Th17/Treg值在慢性乙型肝炎肝纤维化进展中的意义

付海洋 时维平 付广明 张蓓 史海磊 李雪健

[摘要] 目的 测定慢性乙型肝炎（CHB）患者肝纤维化进展过程中外周血中Th17细胞和Treg细胞的频率及相关细胞因子的变化，以及肝组织中Th17细胞和Treg细胞数目的变化，探讨Th17/Treg平衡在纤维化进展中的作用。方法 方便选取2017年6—12月青岛大学附属医院慢性乙型肝炎住院患者51例，其中F1期CHB患者（F1）5例，F2期CHB患者（F2）10例，F3期CHB患者（F3）15例，F4期CHB患者（F4）21例，同时选取10位健康体检者作为对照（HC），流式细胞术检测外周血中Th17和Treg的频数，双抗体夹心ELISA检测血清中IL-17和IL-10的表达水平，免疫组化检测CHB患者肝组织中Th17和Treg数量。 结果 在外周血中， Th17/Treg细胞频率比值在F2组（0.76±0.37）和F4组（2.23±0.67）中与HC组（1.33±0.67）相比，差异有统计学意义[P（HCvsF2）=0.022，P（HCvsF4）<0.001]，IL-17/IL-10比值在F2组（0.11±0.19）、F3组（0.12±0.32）和F4组（0.12±0.32）中与HC组（0.72±0.22）相比，差异有统计学意义[P（HCvsF2）=0.008，P（HCvsF3）=0.001，P（HCvsF4）<0.001]，肝组织中，Th17/Treg比值在F3组（1.07±0.86）和F4組（0.79±0.28）中与F1组（2.08±1.06）相比，差异有统计学意义[P（F1vsF3）=0.008， P（F1vsF4）=0.001]，F2组（1.51±0.77）和F4组（0.79±0.28）相比，Th17/Treg值变化差异有统计学意义[P（F2vsF4）=0.011]。 结论 Th17/Treg的失衡是造成慢性乙型肝炎肝纤维化进程演变的重要因素，检测Th17/Treg变化对预测肝纤维化发展有一定价值。

[关键词] 慢性乙型肝炎;Th17细胞;调节性T细胞;IL-17;IL-10;肝纤维化

[Abstract] Objective To determine the frequency of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood and the changes of related cytokines and the number of Th17 cells and Treg cells in liver tissue during the progression of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis B （CHB）. Role of Th17 / Treg balance in fibrosis progression was explored. Methods A total of 51 hospitalized patients with chronic hepatitis B from the affiliated hospital of Qingdao University from June 2017 to December 2017 were convenient selected， including 5 patients with stage F1 CHB （F1）， 10 patients with stage F2 （F2）， and 15 patients with stage F3 （F3）; 21 cases of F4 stage CHB patients （F4）， 10 healthy subjects were selected as controls （HC）， the frequency of Th17 and Treg in peripheral blood was detected by flow cytometry， and the serum IL was detected by double antibody sandwich ELISA expression levels of IL-17 and IL-10 were detected by immunohistochemistry in the amount of Th17 and Treg in liver tissue of patients with CHB. Results In peripheral blood， the ratio of Th17 / Treg cell frequency in the F2 group （0.76±0.37） and the F4 group （2.23±0.67） was significantly different from that in the HC group （1.33±0.67）[P（HCvsF2） = 0.022， P（HCvsF4）<0.001]， the ratio of IL-17/IL-10 in the F2 group （0.11±0.19）， F3 group （0.12±0.32） and F4 group （0.12±0.32） compared with the HC group （0.72±0.22）， the difference was statistically significant[P（HCvsF2） = 0.008， P（HCvsF3） = 0.001， P（HCvsF4）<0.001]， Th17 / Treg ratio in liver tissues was in F3 group （1.07±0.86） and F4 group （0.79±0.28）， compared with the F1 group （2.08±1.06）， the difference is statistically significant[P（F1vsF3） = 0.008， P （F1vsF4） = 0.001]， compared with the F2 group （1.51±0.77） and the F4 group （0.79±0.28）. The difference in Th17 / Treg values was statistically significant[P （F2vsF4）=0.011]. Conclusion The imbalance of Th17 / Treg is an important factor in the evolution of liver fibrosis in chronic hepatitis B. Detection of changes in Th17 / Treg is of certain value in predicting the development of liver fibrosis.

[Key words] Chronic hepatitis B; Th17 cells; Regulatory T cells; IL-17; IL-10; Liver fibrosis

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒感染引起的复杂的肝脏免疫性疾病。我国作为乙型肝炎高发国家，CHB患者约有2 300万，病毒携带者数量高达1.3亿，每年约有50万以上死于乙肝引起的肝硬化、肝癌。HBV病毒在体内导致的肝纤维化是多种慢性肝病的病变基础，随着纤维化的进展易发展成肝硬化，具有很高的病死率，严重威胁患者的生命健康，因此早期诊断及治疗具有重要意义[1]。乙肝病毒在体内难以清除，关键在于免疫应答不利，近年来研究发现，辅助性T细胞17（T helper cells 17，Th17）与调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）同属CD4+T细胞的两组新亚群，它们在维持机体免疫平衡及自身耐受中具有重要的作用[2]。为此，该研究以CHB患者为研究对象，方便选取2017年6—12月青岛大学附属医院慢性乙型肝炎住院患者51例，检测CHB患者肝纖维化进展过程中外周血中Th17与Treg细胞频率及相关细胞因子水平的变化，以及肝组织中Th17与Treg细胞的数目，并选取10例健康者作为对照，分析Th17/Treg细胞的失衡与肝纤维化发生发展的相关性，并探讨其意义，现报道如下。

1  对象与方法

1.1  研究对象

方便选择青岛大学附属医院消化内科及肝脏科CHB住院患者51例，男34例，女17例，其中F1期CHB患者（F1）5例，F2期CHB患者（F2）10例，F3期CHB患者（F3）15例，F4期CHB患者（F4）21例。慢性乙型肝炎性肝纤维化程度分级、分期标准参照2015年中华医学会肝病学分会与感染病分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》，同时选取10位健康体检者作为对照组（healthy controls，HC），年龄25～46岁（平均年龄44.2岁），无相关免疫性疾病、肿瘤或近期感染。组间性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。该研究经医院伦理学委员会批准，患者、体检者均知情同意。

该研究所用的主要试剂和仪器如下：PMA购自Sigma公司，Ionomycin购自Veasen公司，1640培养基购自Hyclone公司，Human Th17/Treg Phenotyping Kit试剂盒购自BD 公司， 人白介素17 酶联免疫试剂盒和人白介素10 酶联免疫试剂盒购自博凌科为公司，免疫组化一抗IL-17和Foxp3购自北京博奥森生物技术有限公司，苏木素、伊红、Masson三色试剂购自珠海贝索生物技术有限公司。EVOLIS全自动酶标仪为Bio-Rad公司产品，FACSCanto plus流式细胞仪为BD？Biosciences公司产品。

1.2  方法

1.2.1  流式细胞术检测Th17和Treg细胞的频率  采集每组实验者清晨空腹静脉血2 mL，于EDTA抗凝管中并编号，加入等体积生理盐水混匀，用滴管向底部缓缓加入1/3体积的Ficoll分离液，500 g离心力离心20 min，升7降3，吸取PBMC层，加入2 mL PBS，500 g离心力离心5 min，洗涤两遍。1640完全培养基重悬细胞备用。每个样本取1×106个细胞，用200 μL含刺激剂的培养液重悬细胞，37℃，5%CO2培养5 h。250 g离心力离心5 min后收集细胞，加入2 mL Buffer A固定细胞，室温避光孵育20 min。500 g离心力离心5 min，弃上清，加入2 mL Stain buffer重悬细胞，500 g离心力离心5 min，弃上清。每管加入500 μL 1×Buffer C固定破膜液，室温避光孵育30 min。每管加入2 mL Stain buffer，500 g离心力离心5 min。重复此步骤1次。100 μL Stain buffer重悬细胞，按20 μL/test加入抗体，室温避光孵育40 min。每管加入2 mL Stain buffer，500 g离心力离心5 min。重复此步骤一次。弃上清，加入300 μL Stain buffer重悬后，上机检测。

1.2.2  ELISA检测血清IL-17和IL-10水平  采集每组实验者清晨空腹外周血5 mL，3 000 r/min离心3 min后分离血清储存于-80℃冰箱备用。收集全部标本后，取上述血清标本室温冻融后采用双抗体夹心ELISA测定IL-17和IL-10水平，操作遵循试剂盒说明，在酶标仪450 nm处读取吸光度（A）值。

1.2.3  免疫组化检测CHB患者肝组织中Th17和Treg细胞  采集CHB患者肝穿刺或手术标本，常规10%中性福尔马林固定，组织脱水透明包埋成组织块，收集全部标本后，石蜡切片4 μm，用粘附载玻片捞片，60℃烤片2 h后，切片脱蜡至水，蒸馏水水洗2×2 min，PBS 3×2 min，高压修复2 min，蒸馏水水洗2×2 min，PBS 3×3 min，3%过氧化氢10 min，PBS 3×3 min，加一抗室温孵育1 h，PBS 4×3 min，加二抗室温孵育30 min，PBS 4×3 min，加DAB显色液1～2 min，苏木素复染，晾干封片。由两名资深病理诊断医师对每个切片中6个汇管区的细胞计数总和除以6，得到的平均数作为各个标本中Th17和Treg细胞的数目。

1.3  统计方法

数据资料经过整理后导入SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  各组被检测者外周血中Th17细胞和Treg细胞频率情况

与HC组相比，F3组和F4组患者外周血Th17细胞频率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与HC组相比，F2组、F3组和F4组Treg细胞频率升高差异有统计学意义（P<0.05）。与HC组相比，F2、F4组Th17/Treg值变化差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2  各组被检测者外周血中IL-17和IL-10细胞因子情况

与HC组相比，4组IL-17水平、IL-10水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与HC组相比，F2、F3、F4组IL-17/IL-10值显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3  各组CHB被检测者肝组织中Th17及Treg细胞数目检测结果

与F1组相比，其余3组Th17细胞和Treg细胞数目升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与F1组和F2组相比，F3组和F4组Th17/Treg值降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

HBV感染导致的相关肝病具有发病率高、难治愈等特点，严重威胁人类的健康。对于慢性肝病，肝纤维化是其发展过程中的重要阶段，也是造成肝脏不可逆性损害的重要因素[1]。目前对于HBV感染导致的肝脏功能紊乱的机制尚不明确，近年来的研究表明，HBV感染引起的相关肝病免疫系统失衡与Th17和Treg细胞有关系，二者失衡可引起免疫系统的功能紊乱[2]，主要表现为相关细胞因子和细胞数量的失衡[3]

该实验显示，CHB患者外周血中Th17和Treg细胞频率与HC组相比，均表现为升高的趋势，但两者升高的幅度并不相同，说明在HBV患者中存在Th17和Treg细胞的失衡，具体表现为F1、F2反应初期，以Treg细胞升高为主，其与Th17细胞的比值呈现下降趋势，根据本文数据表明在反应初期阶段，HBV刺激机体使Th17细胞大量分化，产生炎性刺激反应后又促使Treg细胞的分化，而Treg细胞具有负向调控功能，会导致机体清除HBV能力下降，使炎症呈现慢性发展[4]，因此在F3、F4期，Th17细胞升高幅度较Treg细胞显著，表现为对机体产生持续性的炎性刺激，与Treg的比值呈上升趋势，加重机体纤维化的发展。在CHB患者中，Th17与Treg细胞频率的比值大致呈升高趋势，说明在HBV感染过程中，与Treg细胞相比，Th17细胞的分化占据优势地位，使机体保持炎性刺激，而Treg的活化使反应慢性化，加重纤维化的进程，顾娜等人[5]通过研究，将乙肝纤维化患者分为轻中重度3组并检测其外周血中Th17/Treg比值，结果显示随着乙肝纤维化病情的加重，Th17细胞与Treg细胞的表达率呈上升趋势，且其比值与轻度组（1.26±0.32）相比，中度组（1.52±0.41）及重度组（1.76±0.49）患者的Th17/Treg比值呈上升趋势，与该文结果相同。CHB患者外周血中IL-17及IL-10细胞因子与HC组相比，均呈升高趋势，而两者的比值与HC组相比呈下降趋势，但在CHB患者中，其比值呈上升趋势，说明机体受HBV刺激后产生大量细胞因子来抑制感染，但两者升高的幅度也存在差异，具体表现为Th17细胞相关因子IL-17的表达水平强于IL-10的表达水平，IL-17的高表达可以通过激活肝星状细胞加重肝炎的发展，而IL-10的抑制性负反馈调节使HBV清除能力下降，导致病变迁延不愈，进一步肝纤维化的进程[6]，徐笛[7]等通过对健康者和HBV患者进行研究发现，IL-17和IL-10的表达随着纤维化的进展，两者表达水平均升高，IL-17和IL-10的比值呈现上升趋势，与该文结果一致。樊海燕等[8]将乙肝患者分为HBV携带者、急性乙肝和慢性乙肝进行监测外周血中Th17/Treg比值，结果显示3组Th17细胞升高幅度较Treg细胞均为明显，进一步说明，Th17和Treg平衡打破后，机体的炎症反应呈现慢性化发展，使肝炎症加重，促进肝纤维化发展。

然而，Th17/Treg平衡的改变不仅体现在CHB患者外周血中，还体现在肝组织中，且与肝脏组织的免疫炎性应答密切相关。该实验发现，在肝脏组织中，Th17和Treg细胞活化程度与外周血中不相同，肝组织中Th17和Treg细胞均呈升高趋势，说明肝脏启动免疫应答来应对HBV的感染，在初期Th17细胞活化并对肝脏进行炎性损伤时，Th17细胞活化分泌IL-17介导炎性反应，引发免疫应答来抑制炎性损伤，继而刺激肝脏中Treg细胞的活化，其分泌的高水平TGF-β1会抑制Th17细胞分化[9]，控制炎症发展[10]并促进Treg细胞的产生，表现为Treg细胞升高明显，因此肝脏中Th17细胞活化水平不及Treg细胞，Th17/Treg比值呈下降趋势，结果是肝脏长期处于慢性免疫炎性应答状态，加重纤维化的发展[11]，而血液中Th17和Treg细胞的监测可能会有一些不确定的因素，导致与肝脏中的比值变化表現不一致。马海霞[12]通过研究乙肝纤维化患者肝脏组织F1、F2和F3期的Treg/ Th17比值，结果显示肝组织内Th17和Treg细胞均呈上升趋势，而Treg/Th17细胞比值呈上升趋势，F1期为（0.48±0.05），F2期为（0.85±0.15），F3期为（1.09±0.03），差异有统计学意义（均 P<0.001），从其F1、F2、F3期肝脏组织检测结果看Th17/Treg比值变化与该文趋势相一致[（2.08±1.06），（1.51±0.77），（1.07±0.86）]，呈降低趋势，然而未检测相对应的血液中数值变化，但认为HBV是嗜肝细胞性病毒，外周血中Th17和Treg 细胞水平变化与肝脏中相比可能存在差异，而该文结果显示肝脏和血液中Th17和Treg表达虽然均升高，但Th17/Treg比值与血液中比值变化存在一定的差异，推测肝脏中和血液中的可能存在一些因素影响两者的比值变化。

综上所述，从该实验中可以看出外周血及肝组织中Th17/Treg失衡可以影响HBV感染导致的肝纤维化的进程，而且肝脏中的Th17/Treg比值与血液中比值变化存在一定的差异，但其比率变化在一定程度上可以反映HBV感染肝纤维化的进展程度，对于临床干预及治疗具有重要指导意义。

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[12]  马海霞.肝内Treg/Th17平衡在不同阶段慢性HBV感染者中的作用[D].天津：天津医科大学，2016.

（收稿日期：2019-12-13）