DRG中P2X3受体参与艾灸足三里穴缓解肠易激综合征大鼠内脏痛的研究

张方，周云，吴焕淦，翁志军，张智英，赵敏，许琼，刘慧荣，周次利

(1.上海市针灸经络研究所，上海 200030;2.上海中医药大学，上海 201203)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种较为常见的慢性功能性肠道疾病，以持续存在或间歇发作的腹痛或腹部不适，伴排便习惯、大便性状改变和排便后症状改善为主要临床表现，缺乏形态学及生物化学异常改变[1-2]。IBS作为一种消化系统的常见病和多发病，其腹痛、排便习惯改变等临床特点给患者的工作和生活造成很大困扰。然而IBS的病因病机尚未研究清楚，目前认为主要与内脏高敏感、胃肠动力学异常、肠道感染、精神心理、基因遗传、脑-肠轴失调等有关[3-4]，其中内脏高敏感被认为是 IBS的主要生理病理机制之一。

P2X受体属于配体门控性非选择性阳离子通道受体，可表达于与伤害性信息传递有关的初级传入神经元的胞体、中枢端和外周端。研究表明P2X受体在疼痛的传递和慢性疼痛的调节中发挥了重要作用，其中主要是 P2X3及其异聚体 P2X2/3、P2X4和 P2X7受体亚型[5]。P2X3受体被 ATP激活后，在内脏痛觉信号转导中起到重要调节作用[6-7]，并且参与肠道运动、胃肠分泌等功能的调节。Burnstock G等[8-9]研究发现 P2X3、P2X2/3等受体能引起伤害性信息向痛觉中枢传递，且在诸多疾病中得到证实，如肠易激综合征、间质性膀胱炎等[10]。本课题组前期的临床和基础研究也证实针灸治疗 IBS的有效性[11-15]，且筛选出P2X受体中参与IBS内脏痛的主要受体亚型是 P2X2、P2X3、P2X4受体[16-18]，并初步阐释了针灸治疗IBS内脏痛的部分神经生物学机制[19]。但缺乏P2X受体参与艾灸治疗IBS的效应与作用机制的研究报道，本研究主要观察艾灸对 IBS大鼠结肠相关背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)中 P2X3受体的调节作用，研究艾灸调节内脏痛的外周敏化机制，以期为艾灸缓解内脏痛效应机制的阐释提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD新生大鼠(乳鼠，出生5 d)，由上海中医药大学动物实验中心提供[动物许可证号为SCXK(沪)2013-0016]，每10只新生大鼠与1只哺乳大鼠共同饲养，哺乳大鼠自由饮食饮水，饲养环境为12 h昼夜节律交替，室温(20±2)℃，室内湿度 50%～70%适应性饲养。3 d后新生大鼠用于实验，实验过程中对实验动物的操作和处理均符合动物福利的基本原则。

1.2 主要试剂和仪器

戊巴比妥钠(Merck，德国);P2X3受体拮抗剂(M2979，Sigma，美国);生理盐水、液体石蜡、无水乙醇、多聚甲醛、二甲苯、中性树胶粘合剂、十二水合磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司，中国);苏木素、伊红(南京建成生物有限公司，中 国 );Anti-P2X3(ab10269，abcam，英 国 );GAPDH(2118S，CST，美国);羊抗兔 IgG(BA1003，博士德，美国);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)(A0208，碧云天，中国);SYBRGreen PCR试剂盒(208052，QIAGEN，德国);cDNA synthesis 试剂盒(K1622，Invitrogen，美国);艾条(直径0.3 cm，长10 cm)(河南南阳汉医艾绒制品厂，中国);光学显微镜及分析软件(OLYMPUS公司，日本);电泳仪、转印仪(Bio-RAD，美国);ABI ViiA 7 Real Time PCR System(Applied Biosystems，美国)。

1.3 模型制备

按照完全随机设计原则，将所有出生8 d的新生大鼠随机分为正常组8只与造模组32只。正常组新生大鼠不做任何处理，造模组新生大鼠在清醒状态下给予直结肠球囊扩张(colorectal dilatation，CRD)刺激，操作过程参考Al-Chaer ED等[20]慢性内脏高敏感大鼠模型制备过程。操作时先用适量液体石蜡将自制球囊表面润滑，然后顺新生大鼠直结肠生理曲度缓缓从肛门插入，深度约2 cm，到达新生大鼠降结肠位置。用注射器给气囊充气0.2 mL，持续1 min后撤气并将气囊取出，1 h后重复1次同样的刺激。每天刺激1次，连续14 d。刺激结束后大鼠正常饲养，于第36天对大鼠进行AWR评分模型鉴定。

1.4 分组与处理

正常组(NG)无异常，造模组在造模过程中死亡 5只。将剩余27只大鼠随机分为模型组(MG，n=7)、艾灸组(MOX，n=7)、P2X3受体拮抗剂组(A-317491，n=7)、生理盐水组(NS，n=6)。所有大鼠于第37天开始干预。正常组给予与艾灸组相同的固定;模型组给予与艾灸组相同的固定;艾灸组先进行大鼠双侧足三里穴位处剃毛备皮，然后固定好大鼠，采用特制艾条点燃后温和灸大鼠双侧足三里穴[21]，距离皮肤 2～3 cm，以大鼠耐受为度，每日1次，每次15 min，连续干预7 d;P2X3受体拮抗剂组在大鼠髓鞘内注射A-317491(10μL，1μmoL/μL)[22]，每日1次，连续干预7 d;生理盐水组在大鼠髓鞘内注射生理盐水(10μL)，每日1次，连续干预7 d。

1.5 样本采集

标本采集前禁食12 h，以2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。每只大鼠取结肠标本1份，4%多聚甲醛固定 24 h后脱水包埋切片;取 T13-L2、L6-S2节段背根神经节[23-25]标本分3份，1份置于4%多聚甲醛溶液内固定24 h后脱水包埋切片，另2份分别放入冻存管中置于﹣80℃冰箱保存，用于Western blot、RT-qPCR指标检测。

1.6 观察指标

1.6.1 腹部撤回反射(AWR)评分

于第36天(干预前)和第43天(干预结束后)对大鼠进行AWR评分，评分标准参照Al-Chaer ED等[20]的实验操作。评分实验前禁食不禁水8～12 h，以减少粪便形成。CRD刺激方法:利用三通阀将自制球囊刺激仪和医用血压计及注射器连成一体，在大鼠清醒状态下将球囊从肛门顺直结肠生理曲度插入降结肠部位，分别进行20、40、60、80 mmHg 4个不同压力强度的结肠恒压扩张刺激。每只大鼠每个强度压力测量3次AWR评分，每次持续约20 s，同一强度压力之间间隔1 min，不同强度压力之间间隔4 min，取均值作为最后评分值，评分示意图[26]和表如图1、表1所示。

图1 腹壁撤回反射(AWR)评分示意图

表1 腹壁撤回反射(AWR)评分表

1.6.2 组织病理学观察

结肠组织切片常规脱蜡至水;苏木素染色90 s;流水冲10 min;盐酸乙醇分化2 s;流水冲洗5 min;伊红染色 5 min;梯度乙醇脱水;二甲苯透明;中性树胶封片;Olympus-BX53显微镜下观察，采集图片。

1.6.3 免疫组化检测

DRG组织切片常规脱蜡至水;柠檬酸盐缓冲液抗原修复;PBS缓冲液冲洗5 min×3次;0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min(避光);双蒸水冲洗5 min×2次;正常羊血清室温封闭20 min;滴加Anti-P2X3一抗(1:200)4℃过夜孵育;37℃复温45 min;PBS缓冲液冲洗5 min×3次;滴加羊抗兔IgG二抗(1:100)室温孵育30 min;DAB显色1～2 min;双蒸水终止显色;苏木素复染2 min;流水冲10 min;盐酸乙醇分化5 s;流水冲洗5 min;梯度乙醇脱水;二甲苯透明;中性树胶封片;Olympus-BX53显微镜采集图像，Image-Pro PLUS软件采集数据。

1.6.4 Western blot检测

提取DRG组织总蛋白，按0.1 g组织加入1000 μL RIPA裂解液和 10 μL PMSF蛋白酶抑制剂裂解组织，用组织匀浆机匀浆，冰浴30 min以析出蛋白，然后4℃离心，12000 rpm，5 min; BCA法测定蛋白浓度;制备上样品取30 μg蛋白，按上样蛋白体积与5×上样缓冲液4:1的比例混合，99℃水浴加热5 min，以充分变性蛋白，然后 4℃离心，12000 rpm，5 min;12%聚丙烯酰胺凝胶80 V恒压电泳至分离胶底部;电泳结束后，将PVDF膜及凝胶固定于转印夹中，125 V转膜60 min;转膜结束后，剪取 PVDF膜上的目的条带，用 5%BSA室温封闭45 min;将 PVDF膜浸泡于 Anti-P2X3(1:1000)、GAPDH(1:1000)抗体中4℃摇床孵育过夜;PBST洗膜4次，每次10 min;将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)(1:1000)抗体中室温摇床孵育1 h;采用凝胶成像系统进行图像采集，ImageJ软件进行数据采集。

1.6.5 Rt-qPCR检测

DRG组织总RNA抽提，组织匀浆，采用Trizol法提取总RNA，检测浓度、纯度、完整性，取相等量的总RNA，采用SYBRGreen PCR试剂盒、cDNA synthesis试剂盒逆转录 cDNA，所用引物序列由 ABI公司的 Primer Express Software v2.0设计，由华大基因公司合成。P2X3-F，ACCCCACCCCAGAATGAAGA;P2X3-R，AGCTGTAGTTC ACGCAGCGG;GAPDH-F，GGCAAGTTCAACGGCACAGT;rGAPDHR，ATGACATACTCAGCACCGGC。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7500 SDS Software分析。

1.7 统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0对数据进行统计分析。若数据符合正态分布，用均数±标准差表示，若不符合正态分布，用中位数(四分位数间距)表示。若数据服从正态分布且方差齐时，采用One-way ANOVA分析，进一步采用最小显著差法LSD进行两两比较;若数据服从正态分布但方差不齐时，采用One-way ANOVA分析，则进一步采用Games-Howell法进行两两比较;若数据既不服从正态分布，方差也不齐，则采用Kruskal-Wallis H检验分析，进一步采用Nemenyi法进行两两比较。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察

第36天(干预前)进行20、40、60、80 mmHg不同压力强度CRD刺激下的AWR评分，与正常组大鼠比较，造模组大鼠结肠敏感性增高(P＜0.05)，从行为学的角度提示IBS内脏痛大鼠模型制作成功。然后将纳入实验的内脏痛大鼠随机分为模型组、艾灸组、P2X3受体拮抗剂组、生理盐水组。第43天(干预结束后)的AWR评分可见，与正常组比较，模型组大鼠在各个强度压力下的AWR评分均显著增加(P＜0.01)，从行为学角度说明新生大鼠直结肠 CRD刺激后慢性内脏痛敏形成;与模型组比较，艾灸组、P2X3受体拮抗剂组大鼠在各个强度压力下的AWR评分均显著下降(P＜0.01)，生理盐水组大鼠在各个强度压力下的 AWR评分均无明显变化，说明艾灸能降低 IBS大鼠的内脏高敏感性，髓鞘内注射 A-317491通过阻断外周 P2X3受体的途径降低了内脏痛敏，而髓鞘内注射生理盐水并未改变模型大鼠的内脏痛敏。详见图2。

图2 干预前后大鼠行为学变化

2.2 结肠组织病理学观察

新生大鼠直结肠CRD刺激诱导的IBS慢性内脏痛动物模型不以局部炎性为结肠病理表现，主要体现在行为学方面，结肠病理染色可见，各组大鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐，固有层内有少量嗜酸性粒细胞浸润，间质有轻微水肿，各组间无明显差异。详见图3。

图3 结肠组织HE染色

2.3 结肠相关DRG中P2X3受体表达

背根神经节内 P2X3受体主要表达于神经元中[27]。采用免疫组化法观察 P2X3受体阳性分布情况，发现P2X3受体在中、小直径DRG神经元中分布广泛，染色较淡。通过半定量分析结果显示，与正常组比较，新生大鼠直结肠 CRD刺激能够上调 P2X3受体蛋白表达，染色较深，呈阳性或者强阳性反应(P＜0.01);与模型组比较，艾灸和髓鞘内注射A-317491能够下调新生大鼠直结肠CRD刺激诱发的P2X3受体阳性表达，染色较淡，呈阳性或者弱阳性反应(P＜0.01);髓鞘内注射生理盐水没有明显改变新生大鼠直结肠CRD刺激诱发的P2X3受体阳性表达，染色较深，呈阳性或者强阳性反应。详见图4A-B。

与正常组比较，新生大鼠直结肠 CRD刺激能够上调正常大鼠结肠相关DRG中P2X3受体蛋白和mRNA表达(P＜0.01);与模型组比较，艾灸组能够下调内脏痛大鼠结肠相关DRG中P2X3受体蛋白和mRNA表达(P＜0.01)，髓鞘内注射 P2X3受体拮抗剂 A-317491也能下调内脏痛大鼠结肠相关 DRG中 P2X3受体蛋白和 mRNA表达(P＜0.01)，而髓鞘内注射生理盐水对内脏痛大鼠结肠相关DRG中P2X3受体蛋白和mRNA表达没有明显影响，与干预后AWR评分检测结果一致。详见图4C-E。

3 讨论

中医学中没有肠易激综合征这一病名，但从腹痛、腹泻或便秘等临床症状来看，归属于“痛泄”“泄泻”“便秘”等病证范畴。本病病因多为外感时邪、饮食失宜、情志失调、脏腑虚弱、禀赋不足、久病体虚等，病位在肠，主病脏腑为脾胃，与肝相关，病久累及心、肾。中医治疗本病具有一定优势，方法众多，疗效较好，且安全性高[28-29]。艾灸是一种具有中医临床特色的诊疗手段，有温经散寒、行气通络、升阳举陷等功效，方法简便易行、经济实用，无毒性和副作用[30]。足三里穴为足阳明胃经合穴，胃之下合穴，艾灸足三里在治疗消化系统疾病方面有着良好疗效，可通过调节神经-内分泌系统来改善胃肠道功能，通过降低内脏敏感性，提高患者的痛阈而发挥镇痛作用[31]。

感觉神经节是痛觉通路的第一站，DRG是感觉神经节中的主要类型，支配机体包括内脏的大部分部位。感觉神经节中神经元致敏是慢性疼痛外周敏化的一个重要促成因素[32]。P2X3受体高度选择性地表达于外周初级感觉传入神经的中、小直径DRG神经元中，外周端与躯体和内脏直结肠神经纤维末梢相连，中枢端与伤害性信息有关的脊髓背角相连，在疼痛信号的传导及其痛觉敏化的发生、发展和维持中起着重要作用[33-34]。结肠相关DRG神经元中P2X3受体过表达是IBS内脏痛大鼠外周敏化的重要因素[35]。课题组以往研究发现P2X2、P2X3、P2X4受体介导 IBS慢性内脏痛，其中P2X3受体在内脏痛的外周敏化中具有重要作用，并发现针刺缓解内脏痛有P2X3、P2X4等亚型的参与[16-18]。

图4 结肠相关DRG中P2X3蛋白和mRNA表达

本实验研究发现艾灸能够调节IBS内脏痛大鼠结肠相关DRG中异常增高的P2X3受体蛋白及mRNA表达，可能是艾灸缓解IBS大鼠内脏痛外周敏化的作用机制。以机械性CRD刺激新生大鼠模拟的肠易激综合征内脏高敏感，在大鼠成年后内脏高敏感性仍然存在。本实验新生大鼠直结肠CRD刺激诱导的IBS慢性内脏痛动物模型不以结肠炎性为病理表现，主要体现在行为学方面，与以往研究报道一致[20]。本实验中结肠组织病理染色显示各组大鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐，符合临床IBS无形态学改变的结肠病理表现。鞘内注射P2X3选择性拮抗剂A-317491抑制外周P2X3活性，能够明显降低IBS大鼠AWR评分，从行为学角度证明了P2X3在IBS内脏痛中发挥重要作用，而艾灸足三里穴也能够缓解 IBS内脏高敏感状态，提示 P2X3受体可能参与艾灸缓解IBS内脏痛外周敏化的调节机制。本研究对结肠相关DRG神经元胞体中P2X3受体蛋白和mRNA进行检测，发现IBS大鼠结肠相关DRG中P2X3受体蛋白和mRNA表达均上调，艾灸干预能够下调结肠相关DRG中P2X3受体蛋白与mRNA的表达，而A-317491同样抑制了结肠相关DRG中P2X3受体蛋白和mRNA的表达，可见艾灸对P2X3受体蛋白及其mRNA的下调作用与A-317491抑制作用类似，说明艾灸能够调节内脏痛效应器官肠感觉神经外周端 P2X3受体的表达，与本课题组以往研究发现P2X3受体参与电针缓解IBS内脏高敏感的外周神经生物学机制的结果相似[18]。以上实验为结肠相关DRG感觉神经元中P2X3受体参与艾灸缓解IBS大鼠内脏痛的作用机制提供了分子生物学实验证据，但仍存在一些未能解决的问题需要进一步研究，比如外周和中枢其他部位的P2X3受体是否参与艾灸缓解IBS大鼠内脏痛的作用机制，以及 P2X3受体通过什么途径参与艾灸缓解 IBS内脏痛的分子机制仍不明确，还有待于在今后的实验中进一步探索。