吸烟COPD 患者中内质网相关凋亡基因CHOP表达研究

甘桂香 胡瑞成 戴爱国 谭双香

1湖南省人民医院呼吸内科 临床转化医学研究所,长沙410016;2湖南中医药大学,长沙410016

COPD 是危害中老年健康的全球高发病,病情常呈进行性发展,最终导致患者劳动能力丧失和死亡,造成沉重的经济负担。香烟烟雾中的氧化性物质可以通过内质网应激 (endoplasmic reticulum stress,ERS)导致肺结构细胞凋亡,从而促进COPD 的发生、发展[1-2]。而CCAAT 增强子结合蛋 白 同 源 蛋 白 (CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)仅在ERS状态下表达明显升高,其作为ERS的标志,在正常生理状态下基本检测不到。本研究采用原位缺口末端标记法 (terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)方法检测肺结构细胞的凋亡,本研究通过免疫组织化学、免疫印迹、聚合酶链反应检测COPD 患者中CHOP 的表达,从而为COPD 的防治提供新方向。

1 对象与方法

1.1对象与试验试剂及仪器

1.1.1临床标本的收集 临床肺组织标本均来自于湖南省肿瘤医院2008年6月至2010年3月因肺鳞癌行肺叶切除术的患者。研究均获得湖南省人民医院医学伦理学委员会的批准 (科研批号2011-10),并在该委员会的监督下进行,所有参与人员均被告知详情并且签署知情同意书。且所有患者术后经病理确诊均为肺鳞癌,且术前均未接受生物反应调节剂、放射治疗及化学药物等治疗。患者术前均详细询问病史、体格检查,并且抽血查血常规及凝血功能、血糖、肝肾功能、自身抗体谱、甲状腺功能、输血前四项、心电图、胸部CT 扫描等,并行肺功能、血气分析、多普勒超声心动图等检查。并且按照中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组2007 年制订的诊断标准[3]进行COPD 诊断。研究对象包括不吸烟非COPD 患者 (对照组)、非COPD 中重度吸烟者 (吸烟组)、中重度吸烟COPD 患者 (COPD 组)各10例。吸烟指有规律地每日吸1支以上,而且持续1年以上。其程度按吸烟指数(即每日吸烟的包数×吸烟年数)计算;吸烟组再按吸烟指数可分为轻度(吸烟指数＜10包·年)、中度 (10 包·年≤吸烟指数＜20包·年)、重度(吸烟指数≥20 包·年)。不吸烟即是一生中从不吸烟,或者累计吸烟量少于20包。

1.1.2试验试剂以及仪器的来源 β-actin抗体、二喹啉甲酸 (bicinchonininc acid,BCA)法蛋白质含量检测试剂盒、总蛋白提取试剂盒、链霉亲和素-生物素复合物 (strept avidin-biotin complex,SABC)免疫组织化学试剂盒、辣根过氧化物酶标记的二抗、二氨基联苯氨(diaminobezidin,DAB)显色剂均来自武汉博士德生物公司。地高辛标记的CHOP多相寡核苷酸探针来自北京鼎国生物有限公司针对人原位杂交的探针序列;Western印迹化学发光剂购自上海碧云天生物技术公司。人CHOP 上 游 引 物：5'-CACTCTTGACCCTGCTTC-3',下游引物：5'-AGTCGCCTCTACTTCCCT-3';β-actin 上 游 引 物：5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3',下游引物：5'-ATGTCACGCACGATTTCCC-3';逆转录试剂盒来自美国MBI Fermentas公司,DNA Marker来自北京索莱宝生物科技有限公司。蛋白电泳系统购自美国BioRad公司。聚合酶链反应仪购自德国Eppendorf公司。LOGENE PAS 900病理图像分析系统为无锡朗伽生物工程有限公司产品。凝胶成像分析系统为Tanon Gis-2010型。

1.2方法

1.2.1肺组织形态学观察 选取蜡块切片,每例患者选取3 张厚度4μm 的肺组织切片,用二甲苯、酒精依次脱腊至水以后,给予苏木素浸染,用盐酸酒精分化处理后,再用伊红溶液复染,再脱水透明封片,光镜下观察其病理形态学变化。

1.2.2用TUNEL检测肺组织中的凋亡细胞 选取石蜡包块切片,每例患者选3张厚度4μm 的肺组织切片,用二甲苯、酒精依次脱腊至水后,再用胃蛋白酶K 37 ℃消化20 min,给予滴加双氧水甲醇室温30 min以灭活内源性酶处理,再滴上50μl的TUNEL 反应混合溶液,在湿盒中37 ℃孵育60 min,在孵育过程中将盖玻片盖上。按TUNEL检测试剂盒操作方法,DAB 显色,其阳性结果为棕黄色,采用LOGENE PAS 900病理图像分析系统采集和分析图像。

1.2.3原位杂交方法检测肺组织中CHOP 的m RNA 表达 每例患者选取3张厚度4μm 的肺组织切片,采用二甲苯、乙醇脱蜡至水,用3%H2O2封闭10 min以后,再加20μl预杂交液于湿盒内42 ℃恒温箱预杂交3.5 h;加20μl杂交探针溶液,盖上原位杂交专用盖玻片置湿盒内,于40 ℃恒温箱内杂交20 h;在干燥环境中继续杂交2 h,洗涤、封闭,按原位杂交试剂盒说明书依次加入生物素化人抗地高辛、链酶亲和素生物素-过氧化物酶复合物,DAB显色,阳性结果为棕黄色。

1.2.4采用逆转录-聚合酶链反应方法检测肺组织CHOP m RNA 的表达 提取肺组织0.1 g,然后按照说明书所示用Trizol试剂提取总的RNA,采用逆转录方法合成互补脱氧核糖核酸 (cDNA),再以其为模板行聚合酶链反应扩增,其CHOP 的退火温度为56 ℃,扩增产物为307 bp 的长度;其β-actin的退火温度为56 ℃,其扩增产物为260 bp的长度。聚合酶链反应反应条件：在94 ℃预变性3 min,然后在94 ℃变性30 s,反应完成后72 ℃延伸5 min。扩增产物5μl后经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,扩增产物条带在用凝胶数字成像系统(Tanon Gis-2010)处理扫描分析,然后分别测定各扩增带吸光度值,将CHOP 基因扩增条带吸光度值与内参照β-actin 扩增带吸光度的比值作为其m RNA 表达水平的相对指标。

1.2.5免疫组织化学方法检测肺组织中CHOP蛋白质的表达 每例患者选取3张厚度4μm 的肺组织切片,再按照SABC 检测试剂盒操作。用二甲苯、酒精依次脱腊至水以后,再选用3% H2O2封闭10 min,热抗原3次修复以后,每次为10 min,然后将其冷却至室温后滴加封闭液,其一抗用PBS稀释(CHOP 1∶1 000),孵育一抗采取4℃过夜。用DAB显色,阳性结果显示为棕黄色。病理图片采集和分析由采用LOGENE PAS 900病理图像分析系统。

1.2.6Western blot方法检测肺组织中CHOP蛋白的表达 将液氮中肺组织取出后依据总蛋白提取试剂盒说明书方法提取总蛋白,测定蛋白浓度按照BCA 法蛋白质含量检测试剂盒方法说明。根据Western blot实验步骤进行操作。选用12%分离胶、5%的积层胶;其中CHOP一抗1∶2 000封闭液稀释;而二抗1∶5 000封闭液稀释,其增强化学发光法X 胶片显影定影后将扫描至计算机,然后采用图像分析系统(上海Tanon Gis-2010)对扩增产物条带吸光度进行半定量检测,其蛋白表达水平的指标为计算待测条带的吸光强度×面积与其内参照β-actin的吸光强度×面积的比值。

1.3统计学分析 计量资料数据采用±s 表示。采用单因素方差分析比较多个样本,采用SNK-q检验比较组间标本;P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床肺标本获取患者临床资料特点的比较 3组年龄、性别差异无统计学意义 (P ＞0.05),而COPD 组吸烟者构成比率大,且肺功能明显下降(P ＜0.05)(表1)。

2.2患者肺组织的病理学形态变化 光镜下观察各组肺组织的病理形态改变：与对照组比较,COPD 组支气管黏膜充血水肿、支气管上皮细胞脱落,基底细胞排列紊乱,肺泡结构出现明显紊乱,肺泡管、肺泡囊及肺泡扩大明显,肺泡壁变薄、断裂,部分肺泡甚至融合成肺大疱,肺间质增生,大量炎性细胞如中性粒细胞、淋巴细胞等浸润 (图1)。非COPD 吸烟者肺组织结构和对照组相比无明显差异(图1)。

表1 3组患者的临床资料

图1 3组患者肺组织病理学改变 HE ×200 A：对照组;B：吸烟非COPD组;C：吸烟COPD组

2.3患者肺组织结构细胞凋亡 肺结构细胞的凋亡超过增殖是COPD 患者发病的重要机制,对照组、吸烟非COPD 组、吸烟COPD 组凋亡率分别为(13.5±2.4)%、 (25.5±1.7)%、 (32.9±2.9)%;支气管上皮细胞、Ⅰ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞以及Ⅱ型肺泡上皮细胞是其主要凋亡细胞(图2)。

2.4肺组织CHOP mRNA 表达 原位杂交光镜下支气管上皮细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞中均可见CHOP m RNA 的表达,在对照组中弱表达,在吸烟非COPD 组中表达稍强,在吸烟COPD 组中表达较强(图3、4)。

2.5肺组织中CHOP蛋白质的表达 免疫组织化学光镜下支气管、肺泡上皮细胞的胞核中均有CHOP蛋白的表达,在对照组表达最弱,在吸烟组表达稍强,而COPD 组人群CHOP 表达最强(图5、6)。

3 讨论

图2 3组患者肺结构细胞凋亡 TUNEL ×200 A：对照组;B：吸烟非COPD组;C：吸烟COPD组

图3 患者CHOP m RNA 的表达 原位杂交 ×200 A：对照组;B：吸烟非COPD组;C：吸烟COPD组

COPD 是种以气流受限为特征的呼吸系统的常见病。最新研究显示2015年全球COPD 患者人数已超过1亿,2015年全球致死人数多达有300多万人[4]。而在我国2013年COPD 在我国占据疾病死亡原因的第3位,致死人数多达90多万人。在2015年中国流行病学显示20 岁以上人群罹患COPD 人数将近1亿。然而其发病机制目前尚未完全阐明,炎症机制、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡机制、异常修复机制以及凋亡机制是研究的重点,其中肺结构细胞凋亡超过增殖导致肺结构不能维持是COPD 发生、发展的关键机制[1,5-7]。目前研究显示COPD 肺泡上皮细胞凋亡的主要原因由于香烟烟雾引起氧化应激引起,且氧化应激诱导COPD 肺泡上皮细胞凋亡的机制研究不常见。而ERS 诱导肺上皮细胞的结构凋亡机制是近期COPD 发病机制研究中的重要内容[8-9]。

图4 患者CHOP mRNA 的表达

图5 患者CHOP蛋白的表达 免疫组织化学 ×200 A：对照组;B：吸烟非COPD组;C：吸烟COPD组

前期研究基础显示在动物实验中证实了ERS诱导细胞凋亡参与了COPD 的发生、发展[10-11]。而在临床试验部分结果显示与对照组比较,COPD吸烟组上皮层、平滑肌层增厚,支气管上皮细胞部分脱落,肺泡结构紊乱,其管壁大量炎症细胞的浸润,镜下可见肺泡管、肺泡囊及肺泡扩大,部分肺泡壁断裂,甚至融合成肺大疱;且肺结构细胞如Ⅰ型肺泡上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞等凋亡明显增加,而COPD 组吸烟人群与非COPD 吸烟组相比较,其肺功能下降明显,而两者的吸烟指数没有显著差异。由此推测,除香烟烟雾外的其他因素也可导致COPD 的发生、发展[12]。

图6 患者CHOP蛋白的表达

而ERS诱导肺结构细胞的凋亡机制是目前COPD 发病机制研究的热点。内质网主要负责合成、加工、转运真核细胞内蛋白质(膜蛋白和分泌蛋白)和钙离子浓度的调节。多种因素如细胞毒性物质、氧化应激、缺氧、DNA 损伤、病毒感染等可导致内质网腔内错误折叠、未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱,从而出现ERS。香烟烟雾中的氧化应激不可逆的损害肺蛋白,香烟烟雾能够诱导不溶性蛋白的聚集,在肺泡上皮细胞、气道上皮细胞以及肺泡巨噬细胞已证明存在多泛素化蛋白;相似的发现也证实在香烟烟雾暴露的小鼠体内[13];这些错误蛋白不能够有效的清除,从而诱导ERS的发生;ERS 是一把双刃剑,应激时间短和轻中度应激的细胞选择适应性生存,而ERS时间过长或者应激过强则引起细胞凋亡[5,14-16]。哺乳动物ERS介导凋亡主要存在3条信号通路：CHOP 信号通路、凋亡信号调节激酶1-JNK 信号通路以及caspase-12信号通路[10]。其中CHOP 作为位于内质网腔的促凋亡分子,在生理状态下在细胞浆中仅少许表达,而在病理状态下,发生ERS其表达量明显增加。它通过抑制细胞的增殖和通过调节caspase-1和CHOP 下游基因诱导内质网相关凋亡,它也可通过上调Bax表达水平和阻止Bcl-2表达介导细胞死亡,但在ERS状态下表达明显升高,也是其重要标志。本临床研究发现临床部分结果显示对照组人群CHOP 表达量是最低的,在吸烟组人群中CHOP表达明显升高,在COPD 吸烟组中CHOP 的表达进一步显著上升。由此可知CHOP基因表达参与了ERS诱导凋亡的发生、发展。

总之,凋亡机制是目前COPD 发病机制中的研究热点,且研究显示ERS 参与了COPD 的发生、发展[2,11,13]。本研究发现吸烟COPD 人群内质网特异凋亡基因CHOP 表达明显增加,且肺结构细胞凋亡明显增加,然而吸烟COPD 人群是否有其他ERS诱导性凋亡通路还需要进一步证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突