SDF-1/CXCR4介导体外冲击波促进骨折愈合中MSCs的成骨分化作用

陈洪江，罗绍伟，林海明，许建坤，黄钟炼，黄泽彬，陈洁斌，许伟才，胡军

(汕头大学医学院第一附属医院骨科，广东汕头 515000)

自上世纪90年代，Haupt等[1]首先发现体外冲击波(Extracorporeal Shock Wave，ESW)可促进骨折愈合，此后，ESW已被证实可有效治疗骨折延迟愈合或不愈合，其治愈率达70%。

骨折愈合需要多种细胞协调参与，包括骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs作为一种多能干细胞，能分化产生骨、软骨、肌腱、脂肪及肌肉等肌肉骨骼组织[4]。在骨折愈合早期炎症反应中，基质细胞衍生因子-1(SDF-1)从破坏的骨组织中释放并募集骨膜及髓腔中的MSCs 至骨折区域，分化形成骨痂[6]。SDF-1即趋化因子CXCL12，广泛表达于多种细胞，如成骨细胞[7]、骨膜细胞[8]及骨髓、脂肪来源的间充质干细胞，且以自身反馈形式促进MSCs 存活、增殖及分化[10]。

MSCs能表达一系列趋化因子受体，其中趋化因子受体4(CXCR4)即CXCL12的配体，被广泛证实与MSCs 迁移相关[11]。ESW对骨髓MSCs的粘附、迁移、增殖、分化具有促进作用，有研究表明MSCs 的粘附、分化能力相互影响，MSCs 粘附得越多则其成骨分化能力越强。MSCs分泌的SDF-1及表达的CXCR4受体能相互促进MSCs向目标骨组织迁移。

本研究将在前期研究的基础上，探讨适宜能量冲击波促进MSCs向成骨分化过程中SDF-1/CXCR4的作用，为冲击波更广泛应用于骨科疾病临床治疗提供更全面的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取24只4周龄雄性SD大鼠作为骨髓MSCs来源，选取48只12周龄雄性SD大鼠用于体内试验，其外观及反应均良好。动物均采购并饲养于汕头大学医学院试验动物中心。动物的饲养和试验方案遵守中国试验动物管理条例(卫生部第55号文件)及汕头大学医学院动物试验指南。

1.2 大鼠骨髓MSCs的培养及鉴定

取4周雄性SD大鼠以颈椎脱位处死，浸泡于75%酒精中5 min后移入超净工作台中，分离双侧股骨及胫骨并仔细剔除软组织与骨膜，用PBS漂洗3次，然后用无菌注射器抽取完全培养基(含10%胎牛血清的αMEM培养基)反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液离心并用完全培养基调整细胞数为1×106/mL后接种于培养瓶中，于37℃、标准湿度、5%CO2细胞培养箱中静止培养，72 h后半量换液，以后隔3 d全量换液。当细胞达到90%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1：3比例传代至第3代细胞以供实验使用[15]。将获得的第3代细胞用成骨诱导培养基培养21 d后，用茜素红染色鉴定其成骨分化能力；用成脂诱导培养基培养10 d后，用油红染色法鉴定其成脂分化的能力。

1.3 体外试验分组及大鼠间充质干细胞的体外冲击波处理

体外试验分空白对照组(Ctrl组)、冲击波组(ESW组)及CXCR4特异抑制剂AMD3100组(AMD组)[16]。取第3代MSCs，与AMD3100 共培养24 h后，经冲击波处理作为AMD组细胞；ESW组细胞仅接受冲击波处理；Ctrl组细胞未经任何处理。各组细胞经处理供后续使用，调整细胞密度至1×106/mL后，接种0.5 mL于6孔板，每组实验每时间点设置3复孔供茜素红染色、碱性磷酸酶染色及SDF-1蛋白分泌定量实验使用。

冲击波处理方法：以0.25%胰蛋白酶消化，用完全培养基调整细胞密度至1×106/mL，取1.5 mL细胞悬液置于15 mL无菌聚丙乙烯管内，使用本院泌尿外科惠康VI 型液电式体外冲击波碎石机(惠康VI 型，深圳)，采用间接定位法确定体外冲击波焦点，将聚乙烯管尖底部含细胞悬液部分充分固定于预先均匀涂抹有耦合剂的球囊壁，按照课题组前期运用MTT法确定体外冲击波适宜能量(500脉冲次数、10 kV)进行体外第三代冲击波处理用于后续实验。

1.4 茜素红染色

当Ctrl组细胞达到100%融合度时，各组细胞进行成骨诱导培养，于第5、10、15、20天进行染色及定量分析。染色方法：吸净培养基，PBS漂洗3遍，用95%酒精固定15 min，蒸馏水漂洗3 遍，然后加入1% 茜素红染色液2 mL置室温孵育10 min，蒸馏水飘洗后自然条件下干燥，然后显微镜下观察并拍照记录。茜素红染色后量化的方法：将被染成深红色的矿化钙结节用1 mol/L的HCl溶液溶解后，通过测量在590 nm波长的吸光度，对矿化钙结节进行量化分析。

1.5 碱性磷酸酶染色

当Ctrl组细胞达到100%融合度时，各组细胞进行成骨诱导培养，于第5、10、15、20天进行染色及定量分析。染色方法：吸净培养基，PBS飘洗3遍，0.4%多聚甲醛固定10 min，PBS再次冲洗2遍并吸净残余液体。按照试剂盒说明书配制孵育工作液(碱性磷酸酶显色缓冲液∶BCIP∶NBT= 300∶1∶2)，每个6孔板加入1 mL工作液，室温避光孵育直至显色至预期深浅，吸去工作液并用蒸馏水漂洗终止显色反应，自然条件下干燥后扫描记录。

碱性磷酸酶的定量测定：各组细胞分别于第5、10、15、20天更换新鲜培养基，并于24 h后取上清液，按试剂盒操作说明在酶标板上分测定孔、3孔标准孔及3孔空白孔，每测定孔加入各组细胞上清液5 uL，每标准孔加入浓度为0.1 mg/mL酚标准液5 uL，每空白孔加入双蒸水5 uL。每孔继续加入缓冲液50 uL、基质液50 uL，充分混匀后，将酶标板置于37 ℃水浴15 min，各孔加入显色剂150 uL，轻轻振摇孔板均匀，在波长520 nm下，酶标仪测定各孔吸光度。测定后计算碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量,公式如下:ALP(金氏单位)=(测定孔吸光度-空白孔吸光度)/(标准孔吸光度-空白孔吸光度)×酚标准液浓度×100 mL,金氏单位定义:100 mL液体在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位。

1.6 体外冲击波促进SDF-1分泌

经处理后4、8、12、24 h收集各组培养基，采用双抗体夹心ELISA法，用抗大鼠SDF-1单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的SDF-1与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠SDF-1，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450 nm处测吸光度(OD)，SDF-1浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中SDF-1浓度。

1.7 动物模型制作及X线检查

采用48只12周龄雄性SD大鼠制作右侧股骨骨缺损模型，随机分成Ctrl、ESW及AMD 3组各16只(术后第4、8周各8只)，PLGA支架置于各组细胞悬液(1×106/mL)中的培养箱培养4 h后备用。采用右侧股骨中段骨缺损模型，各组骨缺损处植入载有该组细胞的PLGA支架，AMD组术后接受AMD3100注射(1 mg/kg/day)，于术后第4、8周取材。

模型制作方法：用1.5 %戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，备皮并用碘酒及酒精消毒，打开膝关节腔后，从膝关节面置入合适大小的克氏针以获得稳定固定，分离右侧股骨后，用钢锉将右股骨中段锉出5 mm长、1/2周径的骨缺损，置入PLGA支架。术后使用X线检查模型是否成功，切口定期换药，连续3 d抗生素肌肉注射预防感染，AMD3100 融于生理盐水(浓度1 mg/mL)对AMD组大鼠进行腹腔注射(1 mg/kg/day)，余2组注射等量空白生理盐水。

1.8 Micro-CT评估新形成骨情况

于术后第4 周和第8 周，颈椎脱位处死大鼠获取右股骨标本，取出克式针并剔除非缺损处的软组织，用10%福尔马林固定24 h后，置于micro-CT设备中扫描整个骨缺损区后供H-E染色及免疫组化使用

1.9 H-E染色及免疫组化

于术后第4、8 周拉颈处理大鼠，取右侧股骨剔除肌肉，经10%福尔马林溶液固定24 h、10%EDTA脱钙6周及乙醇梯度脱水等处理后，进行石蜡连续切片(厚5 μm)，随后通过H-E染色计算新生类骨质相对面积评估骨缺损愈合情况，按照免疫组化试剂盒分析骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)表达。

1.10 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差表示，方差分析法(ANOVA)用于进行多组均数的比较，t检验用于分析两组之间各种均数的比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠间充质干细胞形态及分化鉴定

从骨髓中获取贴壁成长的细胞，在倒置显微镜下100倍镜观察可见细胞呈纺锤形、长梭形等形态，大小形态均一并呈集落生长[图1(a)]。MSCs经成骨分化诱导3周后，肉眼可见大小不等的灰白色结节，结节经茜素红染色后呈现深红色，说明其具有良好的成骨分化能力[图1(b)]；MSCs经成脂分化诱导10 d后，镜下可见细胞内有脂滴形成，经油红染色后呈红色，说明其具有良好的成脂分化能力[图1(c)]。结果显示，MSCs具有良好的多向分化潜能。

2.2 茜素红染色、ALP染色及分泌SDF-1测定

将Ctrl组、AMD组及ESW组的MSCs培养至Ctrl组细胞融合后，进行成骨诱导(第5、10、15、20天)，分别进行茜素红染色及ALP染色，并对染色结果进行定量分析。从图2(a)结果可以看出，ESW组的钙结节染上茜素红的颜色明显深于Ctrl组及AMD组，表现了明显的成骨能力；ESW组大部分贴壁细胞的胞浆及胞外基质被染成蓝紫色的颜色明显深于Ctrl组及AMD组，表现了强烈的ALP活性。从定量分析结果也可以看到[图2(b)-(c)]，ESW组在各个时间点(第5、10、15、20天)的茜素红吸光度及ALP活性染色明显高于其他实验组。而ALP和钙含量测定分别是成骨分化的早期和晚期的定量分析标志性指标，这些结果进一步验证了ESW效应促进MSCs 成骨分化作用明显增强，而这种增强效果可以被CXCR4受体拮抗剂AMD3100所部分抑制，仅存少许对MSCs成骨分化的作用。

酶联免疫吸附试验(ELISA)测定SDF-1分泌型蛋白表达设置3个复孔，重复3次。如图2(d)结果示ESW组SDF-1分泌量较Ctrl、AMD组呈现显著增高，随着时间推移，SDF-1表达量在不同时间点均逐渐增多，且统计学有统计意义(4h时P<0.05；8、12 h时P<0.05；24h时P<0.001)。

2.3 大鼠骨缺损模型及骨愈合的Micro-CT 3D重建

选取外观及反应良好的12周龄雄性SD大鼠制造右侧股骨干1/2骨缺损模型[图3(a)]，将PLGA支架植入大鼠骨缺损部位[图3(b)]，术后进行X线检查，了解股骨是否存在骨折及骨缺损情况，X线片显示各组骨缺损克氏针内固定情况良好以及骨缺损区域的骨缺损制作良好[图3(c)]，白色箭头指示骨缺损部位)。将各组股骨样品收集起来，固定并行Micro-CT扫描。三维CT清晰显示[图3(d)]，PLGA支架植入的ESW组中，术后4周，支架附于骨缺损局部有骨痂形成，而Ctrl组及AMD组骨缺损部位边缘较锐且局部未见明显骨痂形成；术后8周时，支架植入的ESW组骨缺损部位均有丰富的骨痂形成，部分缺损区充满了矿化骨痂，而Ctrl组及AMD组仅有少量矿化骨附于骨缺损边缘。进一步对CT扫描骨体积分数进行统计分析[图3(e)]，结果提示PLGA支架植入的ESW组，较Ctrl组及AMD组明显有更多的新生骨形成并有统计学意义，提示ESW对骨缺损的愈合具有明显的促进作用。

2.4 H-E染色及骨形成蛋白的免疫组化检测

Ctrl组、AMD组及ESW组分别于4、8周后对大鼠股骨进行取材、固定、脱钙、切片，通过H-E染色观察骨缺损部位的组织修复情况。染色结果显示，在4周和8周，随着支架的降解，ESW组比Ctrl组及AMD组明显有更多的类骨质组织形成；H-E染色结果[图4(a)]及统计分析结果[图4(b)]从组织学角度同样表明，ESW具有可促进骨缺损愈合的治疗效果。

进一步通过免疫组化检测Ctrl组、AMD组及ESW组的骨缺损愈合区域组织中OPN表达情况[图4(c)]，结果显示ESW组在两个时间点骨缺损部位OPN的表达量明显高于Ctrl组及AMD组，对骨缺损区域骨愈合中的OPN的光密度统计分析[图4(d)]同样显示ESW组优于Ctrl组及AMD组，且有统计学意义；OPN免疫组化染色的结果，其表达趋势与H-E染色结果保持一致，进一步表明ESW效应对骨缺损区域骨愈合的促进作用。

3 讨论

在本研究开展前，前期相关研究表明ESW具有促进骨髓间充质干细胞的粘附及成骨分化作用，其推断基础之一就是间充质干细胞粘附、分化等生物行为之间存在相互联系。已有研究利用原子力显微镜研究分析细胞骨架、粘附能力及其分化方向之间的关系，得到如下结论：具有结实及平铺的肌动蛋白骨架即粘附能力强的MSCs成骨分化趋势更明显，而具有圆球形、松散的激动蛋白细胞骨架即粘附能力弱的MSCs成脂及成软骨分化趋势显著。因此，如果一个特定的机械力可以诱导成骨细胞分化的MSCs，将可能促进MSCs的粘附。本研究团队早期发现ESW促进大鼠成骨细胞的黏附、迁移和成骨分化能力[18]，结合笔者所获得的结果，即ESW作用能够促进MSCs粘附的研究发现，则再一次说明了细胞生物行为之间的联系。

本实验股骨半缺损模型中应用的PLGA具有很好的生物相容性，PLGA在此模型中提供了细胞支架作用，MSCs治疗的首要基础是其细胞的粘附及迁移，因此在PLGA提供细胞支架的基础上可以大大利于MSCs向骨缺损区域的定向粘附与迁移，通过ESW组相对Ctrl组具有明显促进MSCs向成骨分化的作用，在组织学层面可以观察到在骨缺损区有明显类骨质的骨痂形成；将PLGA制成具有容纳MSCs孔隙的3D立体支架，在体外加载MSCs并进行体外ESW处理，随后植入骨缺损处，这种支架结合了材料和处理方法在成骨方面的优点，是一种可通过体外预处理干细胞提高干细胞治疗疗效及应用于骨折缺损修复的恰当策略，本研究丰富了其应用的基础理论，并说明了该策略的可能性及可行性。

图1 (a)MSCs(3代)100 倍镜下观察，可见细胞贴壁生长，呈长梭形、纺缍形等形态，成集落样生长；(b)MSCs(3代)经成骨分化诱导后经茜素红染液染色，可见许多钙结节被染成深红色(白色箭头)；(c)MSCs(3代)经成脂诱导10 d后进行油红染色，可见许多被油红染成红色的脂滴(白色箭头)。

图2 (a)成骨诱导20 d后，茜素红染色及碱性磷酸酶染色结果显示ESW组的钙结节染上茜素红颜色明显深于Ctrl组及AMD组；(b)Ctrl组、AMD组及ESW组深红色的矿化钙结节及测量吸光度(590 nm波长)，对不同时间点的矿化钙沉积进行量化分析。(c)Ctrl组、AMD组及ESW组细胞检测不同时间点的ALP活性定量值数据；(d)Ctrl、AMD及ESW三组在4、8、12及24 h的MSCs分泌SDF-1量分析，ESW在24 h相对Ctrl组、AMD组有统计差异(P<0.01及P<0.05)；(n=3；*代表ESW组与 Ctrl组及AMD组比较的P 值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

图4 (a)Ctrl组、AMD组及ESW组的骨缺损区域骨愈合的组织切片H-E染色；(b)Ctrl组、AMD组及ESW组的骨缺损区域骨愈合的类骨质相对面积的统计分析，结果显示ESW组类骨质组织的表达明显高于Ctrl组及AMD组，且有统计学意义。(c)Ctrl组、AMD组及ESW组的骨缺损区骨愈合的OPN免疫组化表达情况；(d)Ctrl组、AMD组及ESW组的骨缺损区OPN蛋白表达的平均光密度统计分析，结果显示ESW组优于Ctrl组及AMD组，且有统计学意义。(n=5；*代表其他实验组与对照组比较的P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

骨髓MSCs自身表达SDF-1，且在体外无干涉因素条件下，MSCs有自身迁移的能力。有研究阐明，SDF-1通过自身反馈促进自身的增殖、存活、成骨分化[10]，能够诱导MSCs粘附。低能量剪切力通过增加SDF-1的分泌，以自身反馈的形式增加CXCR4的表达，从而促进MSC的迁移；低频率超声与体外冲击波对于骨折愈合作用具有相似之处，均通过促进SDF-1的局部表达实现作用。而以上的ESW促进效应可以被CXCR4受体抑制剂AMD3100明显抑制，如AMD组在骨缺损区域中的类骨质形成较ESW组减少，结合本研究结果可充分说明，SDF-1及CXCR4受体在ESW促进骨愈合作用过程中具有重要作用。

局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是在细胞粘附、迁移及存活功能中起重要作用的信号分子[23]。FAK在骨骼生长中起到机械传导的作用，亦通过多种处理方式介导迁移的信号通路。MSCs向肿瘤细胞条件培养基的迁移机制之一，即为SDF-1诱导FAK的激活。基于以上分析，ESW对MSCs粘附、迁移的促进作用，除与SDF-1的自身分泌增加有关外，很可能亦与FAK的表达增加有关，笔者对其机制的研究还处于初步阶段，有待进一步探索证明。