益气活血组方对急性心肌梗死大鼠心室重构及心肌纤维化的抑制作用

黄忠明

(达州中医药职业学院，四川 达州 635000)

急性组织损伤后，大量炎症因子释放，诱导巨噬细胞、成纤维细胞增生，其中细胞外基质增生会降低组织器官的顺应性，伴或不伴组织器官结构改变，将进一步影响器官功能，这一过程被称作器官重构〔1〕。急性心肌梗死患者梗死后心室重构是由心肌梗死病变导致心室损伤出现的功能与形态变化过程，心肌细胞损伤后，将引起细胞外基质发生障碍，打乱心肌排列，导致收缩功能异常，这些均是细胞外基质重构的基础〔2〕。心肌纤维化是心肌组织细胞外基质大量沉积，导致的胶原容积与胶原浓度增加、各胶原比例失调与排列维紊乱〔3〕。急性心肌梗死患者心室重构与心肌纤维化均会对其心脏功能产生影响，降低心脏顺影响，增加心源性猝死风险〔4〕。可见逆转或抑制心肌纤维化与心室重构对治疗进行心肌梗死的重要意义。益气活血组方被胡国恒等〔5〕研究证实对加速缺血心肌血管新生、减轻心肌缺氧缺血情况有着重要价值。但将益气活血组方用于急性心肌梗死是否能获得理想效果无较多报道。本研究观察不同剂量益气活血组方进行短期治疗对急性心肌梗死大鼠心室重构与心肌纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 购入Sprague-Dawley(SD)SPF级大鼠65只，周龄6～8〔平均(7.00±1.00)〕w；体重0.22～0.24〔平均(0.23±0.10)〕kg。本次动物实验获得医院动物委员会批准，相关操作及处理均符合《关于善待实验动物指导性意见》〔6〕中相关规定。

1.2主要试剂 美国Invitrogen公司的胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液、抗生素、台盼蓝，北京益利精细化学品有限公司的二甲苯、甲醛固定液、无水乙醇、水合氯醛、二甲基亚砜，北京贞玉民生药业的75%/95%酒精，Sakura Finetechnical公司的包埋剂，瑞士Roche公司的蛋白裂解液。

1.3主要仪器与设备 日本SANYO提供高压蒸汽灭菌器、制冰机，德国BRAND提供电子移液器，美国Milli-Qufplus提供超纯水设备，德国Leica TCS NT正置荧光显微镜、组织切片机、烤片机，德国Eppendorf公司提供离心机、微量移液枪，海尔公司常温冰箱，美国Forma公司低温冰箱、水浴箱，美国贝克曼公司pH计，美国自然基因有限公司的小动物呼吸机。

1.4建模方法

1.4.1器械准备 制作心肌梗死模型手术用具，包括灭菌手术器械、16号气管插管套管针、电动备皮刀、注射器、纱布、棉签、7-0丝线与3-0丝线。

1.4.2制作大鼠心肌梗死模型 对大鼠使用10%水合氯醛0.3 g/kg经腹腔注射麻醉，电动备皮刀备皮，仰卧位，直视下气管插管，与动物呼吸机连接辅助呼吸，维持正常的呼吸频率及潮气量。将大鼠取左侧卧位，与心电监测连接，常规消毒铺巾。依次将大鼠皮肤剪开，将皮下组织与肌肉剥离，在第4肋间进入到胸腔，使用撑开器将胸部撑开，使用棉球挡住肺组织，沿着心底将心包撕开。对前降支走行范围仔细识别，以肺动脉圆锥与左心耳下缘2 mm左右位置定位标记，对冠脉左前降支缝合结扎，以心脏前壁颜色局部苍白为宜。后彻底结扎，可以发现心电图发生ST-T波改变，部分可有室性心律失常出现。若左室前壁颜色部分转为苍白，且室壁运动减弱，则认为模型建立成功，若无上述表现，可选择其他部位结扎。建模成功后逐层将胸腔关闭，根据大鼠的体动反应，脱开气管插管与呼吸机。严密观察大鼠呼吸，若出现自主呼吸可将气管插管拔除，并吸入氧气。

1.4.3大鼠急性心肌梗死模型的筛选 模型制作结束后，使用超声心动图进行大鼠急性心肌梗死模型的筛选，将不合格模型剔除，同时测量建模成功大鼠接受治疗前的各心电图相关指标基线值。典型心肌梗死后表现包括左室短轴切面发现前间壁心肌结构消失、前壁心肌结构消失，运动幅度消失或减低。模型入选标准：①客观指标：左室射血分数(LVEF)低于60%；②主观指标：至少存在一个层面前壁室壁收缩运动异常。同时符合上述2项指征才能看作是建模成功。65大鼠随机选择10只作为空白对照组(A组)，其他55只大鼠接受急性心肌梗死建模，最终建模成功50只。

1.5实验分组与给药方法 将建模成功的50只大鼠随机分为5组，分别是模型组(B组)、卡维地洛对照组(C组)、益气活血组方低剂量组(D组)、益气活血组方中剂量组(E组)、益气活血组方高剂量组(F组)，各10只。模型组不给予药物干预治疗，给予C组卡维地洛(福安药业集团宁波天衡制药有限公司，国药准字H20000101)10 mg/(kg·d)，溶于生理盐水10 mg/kg中，于每日早晨固定时间直接灌胃给药。A组、B组则给予等剂量生理盐水。治疗干预在建模成功24 h内开始，持续14 d。C组、D组、E组给予低至高剂量的益气活血组方治疗，由达州中医药职业学院附属医院中药房熬制提供，组方包括黄芪50 g、丹参、川芎各25 g，当归10 g，药物浸泡30 min后煎取并浓缩。药物剂量由低至高为12、24、36 mg/(kg·d)。

1.6主要实验指标检测

1.6.1组织取材 组织取材前先对大鼠进行称重，后麻醉大鼠，将其胸腔剪开，心脏暴露后将心脏取出，使用生理盐水冲洗，挤出血液，使用滤纸沾干，后称重，计算大鼠心脏重量指数(HWI)，即心脏重量比体重(HW/BW)。后由梗死中间横切心脏，其余心脏使用眼科镊子剥离弃右室，保留左室，按需分为小份，保存待检。用于组织病理检查的组织使用甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋后切片。

1.6.2主要检测方法 ①采用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠心肌细胞结构，胞核、胞质等形态，苏木精属于碱性物质，能够让胞核内染色质与胞质内核糖呈蓝色；伊红为酸性，可以让胞质与胞外成分着色为红色。②采用Masson染色、天狼星红染色以判断大鼠梗死面积与心肌纤维化程度，以胶原纤维蓝色着色情况评价心肌纤维化程度，经显微镜观察。③心室重构血流动力学与心功能相关参数的检测：采用超声心动图评价，指标包括LVEF、左室短轴缩短率(LVFS)、左室收缩末期内径(LVIDS)、左室重量指数(LVW/BW)、HW/BW等。

1.7统计学处理 应用SPSS20.0统计学软件进行方差分析，LSD-t检验，χ2检验，秩和检验。

2 结 果

2.1各组心室重构与心功能相关参数水平比较 与A组比较，B组LVFS、LVEF水平显著降低(P<0.05)，LVIDS水平显著升高(P<0.05)；与B组比较，C组、D组、E组、F组，LVFS、LVEF水平显著升高，LVIDS水平显著降低(P<0.05)，且F组LVFS、LVEF水平最高、LVIDS水平最低，F组与E组、C组与D组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2梗死周围区域组织病理结构变化情况 在灌胃后各大鼠心肌均有病理改变出现。经HE红染色结果发现，同A组相比，各模型组左室发现明显的病理生理学改变，梗死边缘心肌细胞伸长、肥大，左室壁心肌部分凝固性坏死，胞质呈染色呈深染状；此外，部分发生心肌细胞变性、肿胀、坏死、溶解，肌原纤维不同程度扭曲，可见不同程度炎性细胞浸润，心肌纤维出现裂解，有广泛坏死病变。各治疗组治疗结束时可以发现多数病灶有效稀释，极个别仍可见少量的炎性细胞浸润、肌原纤维溶解及纤维组织增生。见图1。

表1 各组心室重构与心功能相关参数水平比较

与A组比较:1)P<0.05；与B组比较:2)P<0.05；与C组比较:3)P<0.05；与D组比较:4)P<0.05；表2同

2.3各组梗死胶原面积、Ⅰ/Ⅲ型胶原值比较 A组梗死周围胶原面积、Ⅰ/Ⅲ型胶原值最小，后依次为F组、E组、D组、C组、B组(P<0.001)。C组与D组、E组与F组上述指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组梗死周围胶原面积、Ⅰ/Ⅲ型胶原值比较

3 讨 论

心肌纤维化形成的机制复杂，是胶原合成与降解代谢之间失衡的结果，若心力衰竭发生使心肌细胞与心肌间质细胞流失、心肌成纤维细胞增殖、心肌成纤维细胞表型转变、成纤维细胞分泌与合成胶原蛋白成分异常，将引起Ⅰ型与Ⅲ型胶原比值变化，加重心肌胶原沉积程度。加之促胶原蛋白降解及基质金属蛋白酶活性表达下调，在其共同作用下将增加胶原的合成而胶原的降解降低，故而诱发心肌纤维化〔7～9〕。急性心肌梗死患者心肌纤维化是一个连续变化的过程，其导致的各区域室壁变化能够反映患者心室重构发生与发展，故治疗急性心肌梗死，应重点改善患者心室重构与心肌纤维化状态，对抑制左室进行性扩张与变形、改善心功能意义重大〔10〕。Ⅰ、Ⅲ型胶原中Ⅰ型胶原起到支架的作用与正常功能维持作用，而Ⅲ型胶原则是决定胶原纤维弹性的基本要素〔11〕。本研究各模型组胶原堆积，且Ⅰ型胶原占主导，这会影响室壁弹性，而在给予D组、E组、F组大鼠益气活血组方治疗14 d后，大鼠胶原纤维明显缩小，且随着药物使用剂量的增加，胶原纤维面积缩小情况越好；此外，各组经药物治疗的大鼠在治疗后，其Ⅰ/Ⅲ型胶原比值降低，室壁代偿运动能力提高，且与西药治疗比较，中/高剂量益气活血组方的应用带来的治疗价值更高。上述结果均表明，益气活血组方对急性心肌梗死大鼠心肌纤维化有很好的抑制之效，且以中/高剂量药物的使用更具价值。既往研究指出，中药单体、复方汤剂、中成药等对急性心肌梗死大鼠心室重构也有一定作用，甚至可能较西药的使用更具优势〔12,13〕。本研究结果提示益气活血组方更利于改善急性心肌梗死大鼠心室重构。益气活血组方中剂量与高剂量的使用在各疗效指标方面比较未见差异，故为了保证治疗的安全性，可以优先选择中剂量。益气活血组方全方有祛瘀生新、益气活血的效果，全方由当归、黄芪、丹参、川芎四味药合制而成，临床上主要用于急性心肌梗死的气虚血瘀症的治疗，药物在使用后能够帮助患者的临床症状得到显著改善〔5，14〕。方中黄芪能够大补元气，还能滋补宗气、调和营卫，其为君药〔15〕；当归作为臣药使用，能够活血通络化瘀〔16〕；丹参为佐药，可凉血调血活血；川芎为使药，通经活血，走而不守〔17〕。诸药合之用之，可促元气恢复，调肠气血，络通则病除。

综上所述，短时间治疗干预下，使用中、高剂量的益气活血组方治疗急性心肌梗死更具价值，大鼠心梗后心室重构得到明显改善，有效抑制心肌纤维化，大鼠心功能受心肌梗死影响减轻。