CD55、CD59联合嗜水气单胞菌毒素变异体检测对PNH的诊断价值

鲁家才， 黄 莹， 莫 扬， 周小芬， 姚 欣

（襄阳市中心医院 湖北文理学院附属医院，湖北 襄阳 441021）

CD55、CD59属于糖化肌醇磷脂（glycosylphatidylinositol，GPI）锚链膜蛋白，普遍存在于血细胞膜上。PIG-A基因突变可导致GPI锚链膜蛋白合成障碍，引起补体活化和细胞溶解。CD55、CD59缺陷是阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的主要临床特征，部分干细胞疾病和淋巴增殖性疾病均可检出PNH克隆[1-2]。嗜水气单胞菌毒素变异体（fluorescent aerolysin，FLAER）能与细胞膜上的GPI锚链膜蛋白结合，聚合成多聚体，插入细胞膜脂质中，形成孔洞，使细胞渗透压改变，从而被溶解。然而，血型糖蛋白与嗜水气单胞菌毒素结合力较弱，限制了FLAER对红细胞的检测能力[3]。本研究旨在探讨CD55、CD59联合FLAER检测对PNH的诊断价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年3月—2017年7月襄阳市中心医院血液科贫血住院患者157例，其中男87例、女70例，年龄（48.1±19.3）岁。根据贫血诊断标准[4]，将其分为缺铁性贫血（iron deficiency a n e m i a，I D A）3 8例、巨幼细胞性贫血（megaloblastic anemia，MA）23例、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）27例、再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）25例、自身免疫溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）31例、PNH 13例。另选取襄阳市中心医院体检健康者20名，作为正常对照组，其中男10名、女10名，年龄（48.9±14.5）岁，均无贫血史。

1.2 仪器与试剂

FC500流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；CD59-FITC、CD55-PE、CD45-PerCP、红细胞裂解液购自美国BD公司；CD15-PE、CD14-APC、FLAER-FITC和磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 方法

采集所有研究对象2.0 mL外周血，并进行乙二胺四乙酸二钾抗凝处理。

1.3.1 红细胞标记及检测 取5 μL抗凝全血，加入含100 μL PBS的流式专用试管中，轻轻混匀，分别加入20 μL CD59和20 μL CD55，混匀，避光孵育15 min后，加入1 mL PBS，待检。在FSCSCC散点图上选定红细胞群，设门、圈出欲分析的细胞群，计算红细胞CD55和CD59表达水平。

1.3.2 粒细胞标记及检测 取100 μL抗凝全血，加入流式专用试管中，加溶血素1 mL，充分混匀，避光孵育10 min后，300×g离心5 min，弃上清液，加入1 mL PBS，300×g离心5 min，弃上清液，分别加入20 μL CD59和20 μL CD55，混匀，避光10 min后，加入0.3 mL PBS，待检。在FSCSCC散点图上选定粒细胞群，设门、圈出欲分析的细胞群，计算粒细胞CD55和CD59表达水平。

1.3.3 粒细胞、单核细胞FLAER检测 取100 μL抗凝全血，加入CD45、CD14、CD15、FLAER抗体各10 μL，避光孵育30 min后，加溶血素2 mL，室温下避光10 min，溶血完全后300 ×g离心5 min，弃上清液，用2 mL PBS洗涤2遍，重新悬于500 μL的PBS中，上机检测。分析8 000个有核细胞，以SCC/CD45设门，分别圈出粒细胞和单核细胞。以FLAER-/CD15细胞百分比为粒细胞PNH克隆数，以FLAER-/CD14细胞百分比为单核细胞PNH克隆数。

1.4 统计学方法

由于外周血CD55-、CD59-离散程度较大，故数据资料采用CD55-、CD59-百分比表示。将CD55-、CD59-百分比＞10%视为对PNH有诊断价值；另将FLAER-百分比＞0.5%视为存在PNH克隆，对PNH有诊断价值[5]。呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红细胞和粒细胞CD55、CD59检测结果

正常对照组红细胞和粒细胞CD55-、CD59-百分比均＜5%，PNH组红细胞和粒细胞CD55-、CD59-百分比均＞20%，PNH组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。PNH组CD55、CD59、FLAER阴性患者（阴性细胞过高患者）粒细胞CD55-、CD59-百分比分别高于红细胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），见表2。

表1 各组CD55-、CD59-、FLAER-百分比 %，±s

表1 各组CD55-、CD59-、FLAER-百分比 %，±s

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与红细胞和粒细胞CD55-、CD59-比较，#P＜0.05

组别 例数 红细胞CD55-红细胞CD59-粒细胞CD55- 粒细胞CD59- 粒细胞FLAER- 单核细胞FLAERIDA组 38 3.61±1.63 2.22±1.97 2.24±1.47 2.71±2.80 0.02±0.03 0.03±0.02 MA组 23 3.32±1.31 2.46±1.89 2.35±1.77 2.51±0.90 0.03±0.02 0.03±0.02 MDS组 27 4.41±3.63 3.55±4.57 6.53±11.31 3.65±3.76 2.13±7.11 0.73±1.31 AA组 25 5.41±8.33 4.64±3.45 5.90±8.65 6.19±7.34 6.54±5.20 6.51±4.16 AIHA组 31 5.53±4.12 4.07±5.41 1.65±1.31 2.17±1.35 0.05±0.04 0.03±0.02 PNH组 13 27.52±15.50* 28.65±14.55* 45.10±15.20* 47.30±14.20* 75.10±20.30# 71.32±15.20#正常对照组 20 3.63±2.24 1.43±1.94 2.07±1.47 2.78±2.27 0.02±0.02 0.17±0.12

表2 各组CD55、CD59、FLAER阴性患者CD55-、CD59-百分比 %，±s

表2 各组CD55、CD59、FLAER阴性患者CD55-、CD59-百分比 %，±s

注：与红细胞CD55-比较，*P＜0.05；与红细胞CD59-比较，#P＜0.05

组别 例数 红细胞CD55- 红细胞CD59- 粒细胞CD55- 粒细胞CD59-MDS组 2 6.73±4.34 2.41±4.89 6.82±7.34 4.60±4.28 AA组 4 9.77±5.57 5.75±3.44 10.86±7.65 12.73±5.57 AIHA组 2 12.36±6.72 9.12±8.15 1.67±1.28 2.16±1.57 PNH组 13 27.52±15.50 28.65±14.55 45.1±15.20* 47.30±14.20#

2例MDS患者和4例AA患者CD55-、CD59-表达为阳性，但红细胞、粒细胞表达没有一致性。2例AIHA患者红细胞CD55-、CD59-表达增多，但粒细胞表达正常。IDA和MA患者红细胞和粒细胞CD55-、CD59-表达均正常。

2.2 粒细胞和单核细胞FLAER检测结果

PNH组粒细胞和单核细胞FLAER-百分比均＞50%，显著高于红细胞和粒细胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05）。7例AA患者FLAER-百分比显著高于4例MDS患者（P＜0.05），见表3。IDA和MA患者粒细胞和单核细胞FLAER-表达均正常。

表3 各组CD55、CD59、FLAER阴性患者FLAER-百分比 %，±s

表3 各组CD55、CD59、FLAER阴性患者FLAER-百分比 %，±s

注：与MDS组比较，*P＜0.05

组别 例数 粒细胞FLAER-单核细胞FLAERMDS组 4 2.67±0.87 2.54±0.85 AA组 7 6.70±4.16* 6.31±4.03*PNH组 13 75.10±20.30 71.32±15.20

2.3 CD55、CD59与FLAER检测结果比较

CD55、CD59与FLAER诊断PNH的符合率为100%。有3例AA患者和2例MDS患者FLAER表达缺失，而CD55、CD59表达正常；有2例AIHA患者红细胞CD55、CD59表达部分缺失，粒细胞CD55、CD59表达正常，FLAER表达正常。

3 讨论

PNH是一种造血干细胞克隆缺陷性疾病，因X染色体上PIG-A基因发生突变，从而导致细胞膜GPI锚链膜蛋白缺陷，CD55、CD59等补体调节蛋白合成减少，细胞对补体敏感性增强，最终引起血管内溶血[6]。PIG-A基因突变在许多疾病中可见，如AA、MDS、浆细胞病、淋巴增殖性疾病[1-2]。本研究结果显示，PNH组红细胞和粒细胞CD55-、CD59-百分比均＞20%，CD55、CD59、FLAER阴性患者粒细胞CD55-、CD59-百分比显著高于红细胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），这可能是PNH患者溶血或输血导致红细胞膜PNH克隆数减少所致。PNH组粒细胞和单核细胞FLAER-百分比均＞50%，显著高于红细胞和粒细胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），说明FLAER检测对PNH克隆检测更敏感。锚链膜蛋白缺失程度与PNH患者病情有关[7-8]。

31例AIHA患者中有2例红细胞CD55-、CD59-表达增多，但粒细胞表达正常，这可能是AIHA患者红细胞GPI锚链膜蛋白轻度受损或被覆盖所致，其FLAER表达未见异常，提示AIHA患者GPI合成没有缺陷。本研究有3例AA患者和2例MDS患者FLAER表达缺失，而CD55、CD59表达正常，提示FLAER检测相对于CD55、CD59检测来说更敏感，更利于较小PNH克隆的检测。

本研究27例MDS患者中有4例伴PNH克隆，这可能是造血干细胞基因错义突变引起GPI合成缺陷所致，这些随机产生的小克隆干细胞并没有获得生长优势，表达不明显，多为一过性出现，故MDS伴PNH患者的总体生存情况一般不受影响[9]。本研究25例AA患者中有7例伴PNH克隆，PNH克隆的发生与AA关系密切，少数病例在某些条件下可互相转化或伴生，即先表现AA后出现PNH克隆，继而转为AA-PNH综合征，PNH克隆可增多、减少或缺失[9-10]。AA患者PNH克隆的出现可能有助于患者血液学指标的恢复，AA-PNH综合征患者无论是血液学反应率还是无病生存率均优于PNH克隆阴性者[11]，故明确AA和PNH的关系可能会有助于早期识别和诊断AA，然而PAH与AA治疗反应之间可能无相关性[12]。

部分PNH患者因全血减少不易与AA、MDS伴有PNH克隆患者进行鉴别诊断，故CD55、CD59联合FLAER检测在PNH诊断及鉴别诊断中有重要价值。FLAER检测能够监测PNH患者或AA、MDS存在小克隆患者的免疫抑制治疗情况，对疾病转归和疗效观察有着重要的作用。