血清组织蛋白酶D检测在非酒精性脂肪性肝病中的临床意义

王茜青， 洪 娟， 杜 超， 褚庆华

（1.上海市浦东新区浦兴社区卫生服务中心检验科，上海 200129；2.同济大学附属第十人民医院检验科，上海 200072）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种常见的慢性肝脏硬变性疾病，其疾病进展与肝炎、肝纤维化乃至肝细胞肝癌的发生相关[1]。目前，肝脏穿刺活检是诊断NAFLD的“金标准”，但由于其有创，操作要求高，无法实现快速实时的检测需求，并存在一定的取样误差，无法作为NAFLD分级诊断的常规方法[2]。因此，临床亟需用于NAFLD早期诊断及进展评估的新型、敏感且特异的血清学指标。组织蛋白酶家族是人溶酶体内重要的水解酶家族，共有15个成员[3]，其中组织蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）是被发现最早，且报道最多的一个成员，不仅在溶酶体内降解蛋白质，还能分泌至细胞外发挥作用[4]。有研究结果显示，CTSD不仅参与了炎症反应过程，同时也是脂质堆积和代谢通路的重要功能蛋白，其与动脉粥样硬化、肿瘤等多种慢性疾病的发展密切相关[5-7]。目前，丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）等血清学指标已作为NAFLD的常规辅助诊断项目，但对于NAFLD的分级缺乏特异性和敏感性。因此，本研究拟探讨CTSD、ALT、AST等指标联合检测在NAFLD中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年3月—2019年3月同济大学附属第十人民医院确诊的NAFLD患者356例，年龄（48.87±6.98）岁，参照《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2018年更新版）》[1]相关诊断标准确诊。按疾病严重程度将NAFLD患者分为轻度组（146例，其中男84例、女62例）、中度组（113例，其中男66例、女47例）和重度组（97例，其中男55例、女42例）。纳入和排除标准：（1）就诊资料、治疗经过等病史记录完整；（2）无饮酒史或饮酒折合乙醇量＜140 g/周（女性＜70 g/周）；（3）排除病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定肝脏疾病；（4）排除药物、甲状腺功能减退以及与胰岛素抵抗相关的综合征等特殊情况；（5）排除正在服用或近期内曾服用可导致肝脏酶谱升高的药物者。选取同期同济大学附属第十人民医院体检健康者300名（正常对照组），其中男171名、女129名，年龄（47.58±5.66）岁，腹部B超、生化检查均正常。本研究经同济大学附属第十人民医院伦理委员会批准，所有对象均自愿参加并签署知情同意书。

1.2 样本采集

采用真空采血管采集所有对象清晨空腹静脉血5 mL，室温下静置30 min，待自然凝集后1 000×g离心10 min，分离血清，置于-70 ℃保存，统一检测。

1.3 方法

采用紫外连续监测法检测ALT、AST、γ-谷氨酰基转移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT），采用终点法检测总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C），试剂盒均购自瑞士罗氏公司，检测仪器为cobas c702全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）。采用酶联免疫吸附试验检测CTSD，试剂盒购自武汉优尔生公司，标准曲线r2=0.974 6，线性范围为46.88～3 000.00 pg/mL，最低检测限为20.32 pg/mL，批内、批间变异系数分别为10%、12%。检测仪器为ELx800酶标仪（美国BioTek公司）。严格按试剂和仪器说明书进行操作。

1.4 统计学方法

采用Graphpad 7.0软件及SPSS 21.0软件进行统计分析。采用Kolmogrrov-Smimov检验进行正态性检验。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。采用Pearson相关分析和Spearman等级相关分析评估各项目之间及与NAFLD严重程度的相关性。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估各项指标诊断NAFLD的价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAFLD组与正常对照组各项指标的比较

NAFLD组血清ALT、TC、TG、LDL-C、CTSD水平高于正常对照组（P＜0.01），且NAFLD各组之间差异亦有统计学意义（P＜0.01）。NAFLD组血清AST、GGT水平高于正常对照组（P＜0.01），且NAFLD重度组高于中度组（P＜0.01）。NAFLD轻度组与正常对照组之间血清AST、GGT水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 正常对照组与NAFLD组各项指标的比较 ±s

表1 正常对照组与NAFLD组各项指标的比较 ±s

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与轻度组比较，#P＜0.01；与中度组比较，△P＜0.01

组别 例数 ALT/（U/L） AST/（U/L） GGT/（U/L）NAFLD组 356 40.60±16.32* 35.21±13.86* 46.31±24.26*轻度组 146 31.34±8.06* 27.69±7.36* 34.15±14.34*中度组 113 40.09±9.05*# 32.65±8.58*# 45.95±18.46*#重度组 97 55.9±20.26*#△ 50.16±14.59*#△ 65.76±29.37*#△正常对照组 300 24.70±9.61 27.65±7.27 35.00±13.39组别 TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL-C/（mmol/L） CTSD/（pg/mL）NAFLD组 1.95±0.50* 5.52±0.97* 3.65±0.55* 18.45±7.18*轻度组 1.61±0.30* 4.91±0.49* 3.38±0.33* 14.25±3.53*中度组 2.00±0.33*# 5.41±0.36*# 3.59±0.3*# 18.31±5.72*#重度组 2.44±0.47*#△ 6.67±0.73*#△ 4.19±0.46*#△ 25.24±7.58*#△正常对照组 1.01±0.48 2.81±1.37 1.95±1.00 7.20±3.76

2.2 血清CTSD水平与NAFLD严重程度的相关性

Spearman等级相关分析结果显示，血清CTSD水平与NAFLD严重程度呈正相关（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。见图1。

图1 血清CTSD与NAFLD严重程度的相关性分析

2.3 血清CTSD与ALT、TC和LDL-C的相关性分析

Pearson相关分析结果显示，CTSD与ALT、TC、LDL-C呈正相关（r值分别为0.541、0.662、0.571，P＜0.01）。见图2。

2.4 CTSD、ALT、GGT诊断NAFLD的价值

ROC曲线分析结果显示，CTSD、ALT、GGT诊断NAFLD的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.940、0.822、0.627，最佳临界值分别为12.67、38.00、53.00，敏感性分别为76.97%、51.69%、34.55%、特异性分别为91.33%、93.00%、92.33%。CTSD与ALT联合检测诊断NAFLD的AUC为0.960，敏感性和特异性分别为88.48%和90.00%。见表2、图3。

图2 CTSD与ALT、TC和LDL-C的相关性分析

表2 CTSD、ALT、GGT诊断NAFLD的ROC曲线参数

图3 CTSD、ALT、GGT诊断NAFLD的ROC曲线

3 讨论

NAFLD是常见的慢性肝病，威胁着全世界20%～30%成人的身体健康[8]。大多数NAFLD患者合并有代谢性疾病，如肥胖、糖尿病及脂类代谢紊乱等。肝脏的脂肪变性在早期阶段通过运动、饮食、药物等的调节是可以逆转的，因此NAFLD的早期诊断对于治疗尤为关键[9]。The Protein Atlas数据库显示肝细胞内富含CTSD蛋白。一项由美国、芬兰合作的多中心研究结果显示，在西方人群中，血浆CTSD水平与NAFLD的进展密切相关，且可用于预测NAFLD的疗效[10]。目前尚无我国人群CTSD水平与NAFLD分级关系的相关报道。本研究结果显示，血清CTSD水平与NAFLD分级呈正相关（rs=0.800 5，P＜0.000 1），且与血清ALT水平呈正相关（r值分别为0.541，P＜0.01）。本研究结果还显示，NAFLD轻度组血清CTSD水平高于正常对照组（P＜0.01）；而作为脂肪肝辅助诊断指标的ALT、AST，在正常对照组与NAFLD轻度组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，CTSD或可作为新的NAFLD辅助诊断指标。

肝脏是合成、储存、转运和分解脂质的重要器官及场所，在脂质代谢中发挥重要作用。肝脏一旦发生脂质代谢异常，脂质沉积会引起肝细胞脂肪变性，同时诱导氧化应激、肝细胞损伤及炎性细胞浸润，导致NAFLD发生，严重者可发展为不可逆的肝病，如肝硬化、肝癌等。有研究结果显示，非酒精性肝炎、动脉粥样硬化等慢性炎症疾病会引起巨噬细胞溶酶体胆固醇蓄积，而组织蛋白酶在调节炎症反应和胆固醇转运的通路中是不可或缺的重要蛋白[11-12]。本研究结果显示，CTSD与TG、TC呈正相关（r值分别为0.662、0.571，P＜0.01），与文献报道一致[10]。

CTSD是溶酶体中主要的水解酶，存在于哺乳动物所有的细胞和组织中，在细胞中发挥剪切、降解多种蛋白质和多肽的作用，并参与免疫调控进程。正常情况下，巨噬细胞内脂蛋白中的胆固醇通过溶酶体水解成为游离胆固醇，被释放进入细胞质，降解为胆汁酸前体。与胆固醇结合的溶酶体大量增加会引起溶酶体酶转运通路的紊乱，从而使血液中的溶酶体酶水平升高。在高胆固醇环境下，细胞内的CTSD水平升高并定位于细胞膜附近，极易被释放入血。这就导致在肝脏脂肪变性的过程中，血清CTSD水平升高。有研究结果显示，CTSD参与了炎症反应及胆固醇转运通路的调节[13]。WALENBERGH等[14]的研究结果显示，血浆CTSD水平与儿童NAFLD密切相关。MOALLEM等[15]的研究结果显示，CTSD与颈动脉内膜中层厚度有关，可作为动脉粥样硬化新的指标，CTSD水平还与溶酶体贮积症的发病有关。本研究发现，NAFLD组血清CTSD水平明显高于正常对照组（P＜0.01），且与NAFLD严重程度呈正相关（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。ROC曲线分析结果显示，血清CTSD诊断NAFLD的效能优于ALT及GGT，且可用于鉴别诊断早期NAFLD，更适合于亚健康人群的筛查。

综上所述，CTSD与NAFLD的进展密切相关，或可作为NAFLD早期诊断及分级的标志物，与ALT联合检测有助于NAFLD的早期诊断和干预。