国产Precil C3510全自动血凝分析仪检测常规凝血项目临床评价

张 强， 林 静， 宗晓龙， 孙 光，刘军锋

（1. 天津市第三中心医院分院检验科，天津 300250；2. 天津医科大学第二医院检验科，天津 300211；3. 天津市公安医院检验科，天津 300100；4. 中国医学科学院 北京协和医学院 泰达国际心血管病医院检验科，天津 300457）

Precil C3510全自动血凝分析仪（简称Precil C3510）是国产全自动高通量血凝分析仪，可通过双磁路磁珠法、发色底物法和免疫分析法检测凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统功能[1]。众所周知，仪器和试剂对血栓和止血实验敏感性影响较大，任何因素导致结果的变化都会影响临床抗凝药物监测治疗[2]。天津市第三中心医院分院引进Precil C3510并在投入使用前，依据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相关指南要求，对Precil C3510的凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）及D-二聚体（D-dimer，DD）等项目不精密度、线性、抗干扰能力、参考区间进行验证。同时，以STA-Compact全自动血凝分析仪（简称STA-Compact）为参考，应用Spearman相关分析、Passing-Bablok回归分析及Bland-Altman图对Precil C3510进行一致性评价。评价Precil C3510检测口服华法林患者国际标准化比值（international normalized ratio，INR）与STA-Compact检测结果的一致性。以STA-R Evolution全自动血凝分析仪（简称STA-R Evolution）检测的抗Xa活性（0.3～0.7 IU/mL）为标准，探讨Precil C3510监测普通肝素治疗的APTT参考区间。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年3—7月天津市第三中心医院分院门诊、住院患者145例，其中65例未接受治疗患者（男36例、女29例，年龄18～83岁）用于Precil C3510与STA-Compact一致性评价，40例接受普通肝素治疗患者（男23例、女17例，年龄39～79岁）用于建立Precil C3510监测普通肝素治疗APTT参考区间，40名口服华法林患者（男22例、女18例，年龄36～74岁）用于INR一致性评价。另选取同期40名志愿者，其中20名（男13名、女7名，年龄37～53岁）用于抗干扰试验，另外20名（男10名、女10名，年龄25～59岁）用于验证参考区间。全部志愿者均排除心脏、肺、肝脏等脏器疾病和肿瘤、严重肾脏疾病、严重糖尿病、血栓类疾病，近期未接受抗凝治疗。采集所有研究对象清晨空腹静脉血3 mL，用3.2%枸橼酸钠抗凝，2 000×g离心15 min分离血浆，4 h内完成检测。样本排除溶血、乳糜血、黄疸，血细胞比容＜55%。

1.2 试剂与仪器

Precil C3510的PT（批号176203011）、AP TT（批号173203012）、F ib（批号172803011）、DD（批号703111L）测定试剂盒购自深圳迈瑞公司。STA-Compact和STA-R Evolution的PT（批号113127）、APTT（批号112907）、Fib（批号113486）、抗Xa（批号003116）测定试剂盒购自法国Stago公司。SX-800i血液分析仪购自日本Sysmex公司。PT、APTT、Fib质控品（生理值047B-E239A，病理值049B-D231A]购自德国TECO公司。DD质控品（生理值1709111，病理值1709119）购自深圳迈瑞公司。胆红素标准品购自美国Sigma-Aldrich公司。脂肪乳（主要成分为三酰甘油）购自无锡华瑞制药公司。

1.3 Precil C3510性能评价

1.3.1 不精密度 根据CLSI EP15-A3指南[3]，分别对不同质控品进行检测，连续5 d，每天重复5次，计算批内、批间均方（MS）、变异分量（V）和标准差（s）。V批内=MS批内，V批间=（MS批间-MS批内）/5，s批内=（V批内）1/2，s总=（V批内+V批间）1/2。以批内变异系数（coefficient of variation，CV）、实验室总CV表示预期不精密度，CV=s×100%/。批内不精密度、实验室总不精密度应在制造商要求标准范围内。

1.3.2 抗干扰试验 收集5 mL全血，1 500×g离心10 min，弃去上层血浆，用10 mL生理盐水洗涤红细胞3次。加入等体积蒸馏水，混匀，4 °C过夜。3 000×g离心30 min，取上清液，所得即为血红蛋白纯溶液，应用SX-800i血液分析仪测定血红蛋白浓度。根据CLSI EP7-A2指南[4]，向志愿者混合血浆中分别加入血红蛋白溶液、胆红素标准品、三酰甘油，制备成一系列梯度浓度的样本，未加为对照样本，分别检测PT、APTT、Fib、DD。计算观察到的干扰效应的“点估计（dobs）”，；计算d临界值，。其中，d是无null效假设规定值，Z1-α/2通常为0，查表为1.96，根据指南[5]通用要求，每个浓度水平重复测定次数（n）为3次。若|dobs|＞d临界值，则表明该浓度干扰物对结果存在干扰。

1.3.3 线性试验 选择经STA-Compact检测FBG分别为7.73 g/L[高值（high-value，H）]和0.62 g/L[低值（low-value，L）]，DD为9.53 mg/L（H）和0.48 mg/L（L）的血浆样品。根据CLSI EP6-A指南[6]，分别按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L制备混合血浆，用Precil C3510检测Fib和DD，重复3次，计算，并进行线性回归分析，决定系统（coefficient of determination，R2）应＞0.95[7]。

1.3.4 参考区间 应用Precil C3510检测各样品PT、APTT、Fib、DD。根据CLSI C28-A3指南[8]，检验数据正态性和离群值，计算各参数、s、95%可信区间（confidence interval，CI）。

1.4 Precil C3510与STA-Compact一致性评价

应用Precil C3510和STA-Compact同时检测65例未接受治疗患者血浆样本PT、APTT和Fib。根据CLSI EP9-A3指南[9]，应用Spearman相关分析评价2台仪器相关性，Passing-Bablok回归分析评价系统差异及比例差异，Bland-Altman图评价随机差异及平均偏移。当Spearman相关系数（rs）＞0.975，Passing-Bablok回归方程截距接近0、斜率接近1，95%偏移位于±1.96s区间内，且2台仪器平均偏移在临床接受区间[1/2 美国临床实验室修正法规（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA'88）允许总误差]内，可认为2台仪器有良好一致性。

分别根据2台仪器APTT各自参考区间（Precil C3510为21～37 s，STA-Compact为37～44 s）将APTT定义为在参考区间内或延长。以Kappa检验比较2台仪器APTT。当Kappa值＞0.8为一致性很好，0.6＜Kappa值≤0.8为一致性较好，0.4＜Kappa值≤0.6为一致性中等，Kappa值≤0.4为一致性较差[10]。

1.5 Precil C3510监测普通肝素治疗的APTT参考区间

应用Precil C3510检测APTT、INR，STA-R Evolution检测抗Xa活性、抗凝血酶（antithrombin，AT）活性。排除INR＞1.5或AT＜30%及接受其他抗凝治疗患者[11]。根据CLSI H47-A2指南[12]，通过APTT与0.3～0.7 IU/mL抗Xa活性线性回归分析结果建立Precil C3510监测普通肝素抗凝治疗的APTT参考区间。

1.6 2台仪器检测口服华法林患者INR的一致性

以STA-Compact作为参考系统，Precil C3510作为待测系统，比较2台仪器INR检测差异。40例口服华法林患者血浆样本中，STACompact检测INR 2.0～4.5为30例，INR＜2.0为5例，INR＞4.5为5例。根据CLSI H57-A指南[13]，Precil C3510 INR在治疗监测范围（2.0～4.5）内，至少85%的样本应与参考系统检测差异＜0.5。

1.7 统计学方法

采用MedCalc 18.2软件进行统计分析。应用线性回归分析确定Fib检测线性及监测普通肝素治疗APTT的参考区间。应用D'Agostino-Pearson检验正态性，Tukey检验分析离群值。应用Spearman相关分析、Passing-Bablok回归分析、Bland-Altman图分析2台仪器一致性。应用Kappa检验分析2台仪器APTT检测一致性。

2 结果

2.1 Precil C3510性能验证结果

2.1.1 不精密度 各参数生理值、病理值质控品批内不精密度为1.35%～7.73%，实验室内总不精密度为1.53%～9.90%，均在制造商提供的允许范围内。见表1。

表1 批内不精密度和实验室内总不精密度验证结果（n=25）

2.1.2 抗干扰能力 对照样本PT、APTT、Fib、DD结果分别为（13.1±0.78）s、（29.8±1.89）s、（3.12±0.21）g/L、（1.16±0.17）mg/L，d临界值分别为0.88、2.14、0.24、0.19。三酰甘油为3.2 mg/mL和4.0 mg/mL时|dobs|=0.19，＞d临界值，对DD检测结果存在负性干扰。其他浓度干扰物（血红蛋白、三酰甘油、胆红素）对各项目测定值无明显干扰（|dobs|＜d临界值）。见表2。

表2 生物干扰物对Precil C3510检测结果的影响

2.1.3 线性分析 Fib的回归方程为Y=0.978 0X+ 0.121 3，R2为0.996 4；DD的回归方程为Y=1.040 9X-0.057 31，R2为0.993 9。Precil C3510 Fib、DD具有良好的检测线性。见表3、图1。

2.1.4 参考区间 20名志愿者PT、APTT、Fib、DD均呈偏态分布，且未发现离群值，采用百分位法表示，参考区间验证选择95%CI（P2.5～P97.5）。PT、APTT、Fib、DD95%CI分别为11.4～13.2 s、21.4～31.3 s、2.51～3.63 g/L、0.33～0.81 mg/L，均在制造商建议的参考区间（PT为9.2～15 s、APTT为21～37 s、Fib为2～4 g/L、DD为0～1 mg/L）内。

2.2 2台仪器一致性评价

Precil C3510和STA-Compact的PT、Fib相关性较好（rs分别为0.990和0.989），Passing-Bablok回归分析结果显示，2台仪器PT、Fib无系统差异[PT截距（95%CI）为-0.060 7（-0.658 1～0.719 1），Fib截距（95%CI）为-0.146 4（-0.253 8～0.000 4）]和比例差异[PT斜率（95%CI）为1.024 8（0.989 4～1.057 8），Fib斜率（95%CI）为1.013 7（0.964 3～1.056 7）]。Bland-Altman图显示，PT[95.38%（62/65）]的偏移位于±1.96s区间内]、Fib[96.92%（63/65）]的偏移位于±1.96s区间内]，均无随机差异，且两者平均偏移均在临床可接受范围内[PT为2.6%（1.4%～3.8%），Fib为-8.2%（-10.1%～-6%）]。2台仪器APTT相关性一般（rs=0.916），且存在系统差异[截距（95%CI）为-18.121 6（-26.003 9～-12.522 1）]、比例差异[斜率（95%CI）为1.261 8（1.123 4～1.435 6）]及随机差异[（92.31%（60/65）]的偏移位于±1.96s区间内，平均偏移[-18.9%（-22.9%～-14.9%）]不在临床接受区间内（表4、图2）。65例未接受治疗患者样本经STA-Compact检测，APTT在参考区间内（37～44 s）23例、延长（＞44 s）42例；经Precil C3510检测APTT在参考区间内（21～37 s）25例、延长（＞37 s）40例。2台仪器对APTT测定值的临床判定具有很好的一致性（Kappa=0.87，95%CI为0.74～0.99）。

表3 线性范围验证结果 g/L

图1 Fib、DD线性分析

表4 2台仪器一致性的比较

图2 2台仪器一致性比较

2.3 Precil C3510监测普通肝素治疗APTT参考区间

抗Xa活性在0.3～0.7 IU/mL时，Precil C3510监测普通肝素治疗APTT参考范围为62～108.1。见图3。

2.4 口服华法林患者2台仪器INR一致性评价

2台仪器口服华法林患者INR检测结果比较，87.5%（35/40）的样本差异＜0.5，其中治疗监测范围（2.0～4.5）内90%（27/30）的样本差异＜0.5。见图4。Precil C3510

图3 普通肝素抗凝治疗范围

图4 口服华法林患者INR结果

3 讨论

本研究依据CLSI系列指南对Precil C3510检测PT、INR、APTT、Fib、DD不精密度、抗干扰能力、Fib线性进行评估验证。在不精密度验证中，CLSI有EP5-A3和EP15-A3指南可供选择。EP5-A3指南常用于仪器制造商建立不精密度声明，但其操作繁琐、测试量较大、试剂成本较高。对实验室来说，可选择周期更短、实用性更强，且更为简易的EP15-A3指南对制造商提供的不精密度声明进行验证[2]。本研究依据EP15-A3选择生理值、病理值2个水平商业化非定值质控品进行不精密度验证，每天检测5次，连续5 d。结果显示，各项目批内不精密度为1.35%～7.73%，实验室内总不精密度为1.53%～9.90%，均低于制造商声明。Precil C3510是以磁珠法对PT、APTT、Fib进行测定，以免疫比浊法对DD进行检测。相较于免疫比浊法，磁珠法可有效避免溶血、乳糜血、黄疸等光学信号干扰物和浑浊样本本底影响，是凝固法检测原理的金标准，在临床中应用更广泛[1]。本研究通过向患者血浆中加入外源性生物干扰物进行抗干扰试验，结果显示，各项目在血红蛋白浓度为1～5 mg/mL、胆红素浓度为0.06～0.30 mg/mL时均无明显干扰；PT、APTT、Fib在三酰甘油浓度为0.8～4.0 mg/mL时无明显干扰，DD在三酰甘油浓度为3.2～4.0 mg/mL时存在明显负性干扰。因此患者三酰甘油高于3.2 mg/mL（3.61 mmol/L）时，DD结果需进一步实验证实。在线性试验中，PT、APTT检测结果是通过仪器直接读取，不适合进行线性分析，因此本研究仅验证Fib、DD线性，结果显示Fib（0.69～7.63 g/L）、DD（0.49～9.49 mg/L）有良好的检测线性。20名志愿者血浆样本各项目测定值95%CI均在试剂说明书提供的参考区间内。

在2台仪器检测结果的相关性研究中，我们发现2台仪器间PT和Fib具有良好的一致性，而APTT则显示出显著的差异。Passing-Bablok回归方程和Bland-Altman图显示，2台仪器APTT测定值存在系统差异、比例差异和随机差异，且偏移超出临床接受区间。这种检测差异可能与2台仪器配套的APTT试剂成分差异有关。Precil C3510配套APTT试剂激活物为鞣花酸，而STRCompact配套试剂激活物为硅土。不同的APTT试剂激活剂类型、磷脂成分和浓度均会对结果产生影响，特别是血浆中存在肝素、狼疮抗凝物、接触因子缺乏等情况时，结果可能存在更大差异[14-15]。这种差异在制造商提供的生理参考区间中也得到了体现，Precil C3510的APTT参考区间为21～37 s，STR-Compact为37～44 s。我们依据2台仪器各自的参考区间，将全部样本分为APTT在参考区间内和延长后，应用Kappa检验分析，结果显示2台仪器对APTT测定值的临床判定具有较好的一致性（Kappa=0.87，95%CI为0.74～0.99）。因此，我们认为尽管2台仪器APTT测定值之间具有显著的差异，但不会由此导致不同的临床决策。

APTT对内源性凝血途径凝血因子（凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ，前激肽释放酶和高分子量激肽原）的缺陷敏感，因此通常用于临床监测普通肝素的抗凝治疗效果。由于不同仪器、试剂间APTT测定值的差异，基于APTT建立的监测参考区间也会存在差异。王霞等[11]应用Sysmex CA7000血凝分析仪和Dade Behring APTT试剂建立的监测参考区间为44.9～91.5 s。而GEENS等[2]应用Sysmex CS5100血凝分析仪及其配套APTT试剂（Actin FS）建立的监测参考区间为60～100 s。因此，建立基于实验室在用仪器试剂系统的APTT监测参考区间，对临床监测肝素抗凝治疗效果具有重要意义。出于实际原因，某些实验室采用体外连续稀释普通肝素混合正常血浆来进行普通肝素APTT监测参考区间的确定。然而由于基质效应的存在，体外方法可能导致APTT治疗范围下限和上限的增加，产生更广泛的治疗范围，从而不能准确地反映患者的肝素水平[16]。因此，CLSI相关指南推荐采用接受普通肝素抗凝治疗患者的血浆样本建立每个独立实验室的APTT监测参考区间[12]。值得注意的是，在建立APTT监测参考区间时尚需排除肝素抗凝剂影响，特别是以华法林为代表的维生素K拮抗剂可通过影响凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ合成导致APTT延长[11]。因此，本研究以INR＞1.5作为排除标准，以确保所筛选的病例未同时应用华法林等口服抗凝剂。此外，有研究发现肝素的抗凝血作用主要依赖于加强抗凝血酶（antithrombin，AT）的活性，而当AT活性＜30%时，肝素抗凝效果较差（肝素抵抗）[17]。因此，本研究选择40例接受普通肝素抗凝治疗患者的血浆样本，并排除INR＞1.5、AT活性＜30%及应用其他抗凝剂患者，建立的本实验室普通肝素APTT监测参考区间为62～108.1 s。

因考虑到所用特定分析系统（包括测试试剂/仪器组合），INR可实现不同实验室不同仪器间PT测定结果的比较，便于用药标准化。本研究选择40例口服华法林患者，其中经STRCompact检测INR在治疗监测范围（2.0～4.5）30例，INR＜2.0和INR＞4.5各有5例。比较2台仪器INR检测结果，发现无论在治疗范围内的30例样本还是全部40例样本，均有超过85%的样本差异＜0.5 INR单位。因此根据CLSI H57-A指南，可认为2台仪器在口服华法林疗效监测中具有较好的一致性。

综上所述，本研究对Precil C3510的性能及其在华法林疗效监测和肝素治疗中的临床应用进行了较全面的评价，其各项检测性能基本良好，可满足临床日常的诊疗需求。值得注意的是，2台仪器APTT测定值仍存在显著差异，这可能与仪器配套APTT试剂激活物不同有关。在应用各自参考区间重新评价APTT后，我们发现2台仪器具有较好的一致性，APTT测定值的差异对临床决策并未造成明显影响。