咖啡酸对LPS诱导小鼠乳腺炎的保护作用

张 雯，王 琳，孙雅丽，马建章

（东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040）

奶牛乳腺炎主要是由于乳腺组织受物理或化学性损伤及微生物等刺激导致的局部性炎症反应，围产期前后发病率较高[1]，严重危害奶牛养殖业，造成经济损失，主要包括产奶量降低、乳品质下降、弃乳，母牛发情延期、配种时间缩短甚至淘汰[2-3]。研究表明，患有乳房炎奶牛乳汁中金黄色葡萄球菌检出率最高，其次是大肠杆菌和链球菌[4]。我国奶牛乳腺炎主要致病菌为大肠杆菌，其外膜含有较多脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），大肠杆菌进入乳腺组织后释放毒性物质可诱导机体产生严重的炎症反应，LPS为主要致病毒力因子，也是引起大肠杆菌型乳腺炎的主因。

目前临床上奶牛乳腺炎仍以抗生素治疗为主，特别是急性乳腺炎，抗生素具有起效迅速且消炎效果明显等特点[5]，但廉价抗生素滥用，造成抗药性等问题日趋严重。因此，寻找替代抗生素新疗法成为乳腺炎防治热点[6]，中草药作为新型治疗奶牛乳腺炎方法前景广阔，研究其对乳腺炎保护作用机制十分重要。咖啡酸是一类天然酚酸类化合物，在各种水果、蔬菜及草药中广泛存在，可清除炎症反应发生时中性粒细胞和巨噬细胞释放的氧自由基，具有抗炎、抗氧化等多种生物学效应[7]，推测咖啡酸对乳腺炎症具有保护作用，但咖啡酸对乳腺炎保护作用的研究鲜有报道。为降低以奶牛为试验动物的高昂成本，以诱导小鼠感染乳腺炎建模，研究该病发生机制应用广泛[8]，且LPS诱导小鼠乳腺炎症模型可有效复制肠杆菌感染乳腺炎反应过程[9]。

因此，本试验通过LPS灌注乳腺导管方式建立小鼠乳腺炎模型，采用H.E.染色、ELISA检测和Western blot检测方法，分别比较各组病理组织学变化、炎性细胞因子水平和炎性信号通路蛋白检测结果，研究咖啡酸对LPS诱导小鼠乳腺炎保护作用及其机制，旨在为奶牛乳腺炎防治提供新药物。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验所用鼠笼、喂水瓶及垫料等高压灭菌并烘干，保证小鼠生存环境清洁卫生。昆明小鼠，雌鼠36只，雄鼠12只，6～8周龄，体重18～22 g，购自哈尔滨试验动物中心，其中12只雌鼠、4只雄鼠用于建立小鼠乳腺炎模型试验；24只雌鼠、8只雄鼠用于研究咖啡酸对小鼠乳腺炎症保护作用。饲养室温度20～25℃，相对湿度40%～70%，先将雌雄小鼠分别饲养48 h使其适应环境，再按照雌雄3∶1同笼饲养。饲养期间饲喂市售鼠粮，保证足够饮水及采食。

1.2 试验动物分组

建立小鼠乳腺炎模型时，将12只雌鼠随机分为对照组和LPS组，每组6只小鼠。研究咖啡酸对LPS刺激小鼠乳腺炎的保护作用时，将24只雌鼠随机分为4组，即对照组、LPS组、LPS+CA（10 mg·kg-1BW）组和LPS+CA（20 mg·kg-1BW）组，每组6只小鼠；LPS+CA（10 mg·kg-1BW）组和LPS+CA（20 mg·kg-1BW）在灌注LPS后1 h腹腔注射咖啡酸，同时空白对照组和LPS组注射等量PBS。

1.3 试剂

LPS（大肠杆菌，血清型O55：B5）购自美国Sigma公司；小鼠TNF-α酶联免疫吸附测定（ELI⁃SA）试剂盒购自Biolegend公司；乙醇、二甲苯、苏木精染液和伊红染液等H.E.染色试剂均购自碧云天生物公司；咖啡酸（纯度99%）购自中国食品药品检定研究院；BCA蛋白分析试剂盒购自北京全试金公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western及IP细胞裂解液、Tween-20、SDS和PBS溶液等Western blot所需试剂均购自碧云天生物公司；鼠源单克隆抗体NF-κBp65、NF-κBp-p65、I-κBα、p-I-κBα、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK以及内参抗体β-actin均购自Abcam公司（中国上海）。所有其他化学品均为试剂级。

1.4 试验仪器

分析天平购自德国Sartorius公司；旋涡混匀器购自江苏新康医疗器械有限公司；紫外分光光度计购自赛默飞世尔科技；切片机购自德国莱卡公司；电热烘干箱购自上海森信试验仪器有限公司；高压锅购自上海博讯试业公司；-80℃超低温冰箱购自上海颐鹏集成设备有限公司；超净工作台购自苏州净化设备有限公司；高速低温离心机购自Eppendorf生命科学公司；电子显微镜购自日本尼康公司；DYCZ-25D型蛋白垂直电泳槽、DYCZ-40D型湿式转印电泳槽和WD-9405E型脱色摇床均购自北京六一生物科技有限公司；酶标仪购自天津瑞泽分析仪器有限公司；凝胶成像系统购自北京百晶生物技术公司。

1.5 小鼠乳腺炎模型建立

将分娩7 d后12只孕鼠与仔鼠分笼，建模前3 h雌鼠禁食禁水，建模前1 h腹腔注射适量乌拉坦将小鼠麻醉。将小鼠仰卧固定在操作台上，75%酒精棉球擦拭第4对乳腺及周围区域皮肤，充分消毒且使其充分暴露，左手持无菌眼科镊夹取乳头并固定，右手用灭菌眼科剪剪除1 mm乳头尖端，暴露乳头导管。用微量注射器吸取0.2 mg·mL-1LPS 50 μL，沿乳头导管缓慢灌注到乳腺内，对照组灌注相同体积PBS。LPS刺激24 h后，断颈法处死小鼠，75%酒精消毒腹部皮肤后，沿腹中线剪开腹部皮肤，暴露第4对乳腺并收集。取适量乳腺组织浸泡在4%多聚甲醛中固定，用于H.E.染色观察乳腺组织病理学变化，其余组织-80℃冰箱冻存备用。

1.6 乳腺组织病理学检测

依次固定-脱水-透明-石蜡包埋-切片-切片脱蜡-苏木精染色-伊红染色-乙醇-二甲苯-封片，制成H.E.切片，并将染色后乳腺组织切片置于显微镜下观察乳腺组织病理学变化。

①固定：将取样乳腺组织于4℃冰箱在4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

②脱水：将固定组织块用PBS缓冲液清洗3次，依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各脱水1 h。

③透明：将脱水组织块表面乙醇吸干后依次放入二甲苯A和二甲苯B中各15 min，直至组织呈透明状。

④浸蜡：将组织块依次放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ中各30 min。

⑤包埋：先将石蜡熔化倒入包埋模具内，再用镊子将浸蜡组织块切面向下埋入熔蜡中，石蜡充分凝固变硬后取出，修整为规则长方形。

⑥切片：用切片机将包埋后石蜡切成厚度为5 μm切片，放在42℃温水中展平并用载玻片附着，最后将切片放入60℃烘箱中过夜烘干备用。

⑦切片脱蜡：将组织切片依次放入二甲苯A和二甲苯B中各15 min，依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5 min，蒸馏水冲洗3次。

⑧染色：将组织切片浸入苏木精染液中5 min，自来水中浸泡20 min返蓝处理，伊红染液中浸泡5 min。

⑨脱水、透明、封片：将组织切片依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各2 min脱水，经二甲苯A和二甲苯B各处理5 min透明处理，用中性树胶及盖玻璃片封片。

⑩镜检：将染色后乳腺组织切片置于显微镜下观察并拍照。

1.7 乳腺组织中炎性细胞因子水平检测

组织匀浆制备：将雌鼠右侧乳腺组织和PBS按照1∶9（W/V，g·mL-1）加入玻璃组织匀浆器中匀浆，充分匀浆后转移至离心管中4℃、2 000 g离心40 min，除去上层脂肪，将上清液转移至新离心管中4℃、2 000 g离心20 min，弃去剩余脂肪，收集上清液转移至新离心管中，测定乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。

按照ELISA说明书，测定两个不同处理组样品450 nm处吸光值，根据数据绘制标准曲线计算各样本TNF-α相应浓度。每组设置3个重复样本，每个样本测定3个重复值。

1.8 蛋白质印迹分析

根据制造商说明，使用Western及IP细胞裂解液提取冻存在-80℃冰箱中小鼠乳腺组织中蛋白质，用BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。依次配胶-加样-电泳-转膜封闭-一抗孵育-洗膜-二抗孵育-洗膜-显影。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离裂解产物中蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用含0.05%Tween-20PBS缓冲盐水（PBST），添加5%脱脂牛奶缓冲液及含5%牛血清白蛋白（BSA）缓冲液，分别在摇床上室温下封闭非磷酸化和磷酸化特异性一抗，封闭时间均为1 h；PBST清洗；特异性一抗在一抗稀释液中稀释比例为1∶1000，与膜在4℃冰箱中孵育过夜；PBST清洗膜；与过氧化物酶偶联二抗在室温下孵育1 h；采用超敏ECL化学发光试剂盒并使用化学发光成像系统Image Quant检测免疫活性蛋白。

1.9 数据分析

所有试验数据结果均用means±S.E.M形式表示。利用方差和Student's t-test分析任意两组数据间差异性。P＜0.05代表差异显著。利用Image J软件分析Western blot结果。

2 结果与分析

2.1 乳腺组织病理变化

镜下观察咖啡酸对乳腺组织病理学变化的影响，试验结果如图1所示。空白对照组小鼠乳腺组织学状态见图1A，乳腺腺泡结构完整，腺泡腔中可见乳汁着色；LPS刺激组小鼠乳腺组织病理学变化见图1B，乳腺腺泡壁明显增厚、水肿，腺泡腔中充满大量嗜中性粒细胞，且可见乳腺组织中明显充血和淤血发生；LPS+CA低剂量组小鼠乳腺组织病理学变化见图1C，乳腺腺泡壁变薄，且无水肿现象，充血情况明显改善；LPS+CA高剂量组小鼠乳腺组织病理学变化见图1D，乳腺组织恢复正常，结构完整。可知，咖啡酸可改善LPS刺激小鼠乳腺组织损伤情况。

图1 不同处理组小鼠乳腺病理组织学切片（400×）Fig.1 Histopathologic sections of different treatments of mice mammary gland（400×）

2.2 乳腺组织中炎性细胞因子检测

利用ELISA检测咖啡酸对小鼠乳腺组织中细胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平的影响，结果如图2所示。

由图2可知，与空白对照组相比，LPS刺激组与LPS+CA-L、LPS+CA-H组TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平显著升高（P＜0.05），而LPS+CA组3种细胞炎性因子表达水平显著低于LPS刺激组，且随CA浓度升高而降低，呈明显剂量依赖。说明咖啡酸抑制LPS刺激小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达，进一步证明咖啡酸对LPS诱导小鼠乳腺炎有保护作用。

图2 咖啡酸对乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的影响Fig.2 Effects of caffeic acid on the production of inflammatory cytokine TNF-α,IL-1β and IL-6 in mammary gland

2.3 咖啡酸对小鼠乳腺组织NF-κB信号通路的影响

通过Western blot方法检测IκB和p65蛋白的磷酸化水平，探究咖啡酸对NF-κB信号通路激活情况，结果如图3所示。LPS刺激小鼠乳腺组织显著激活IκB和p65蛋白磷酸化，咖啡酸则显著降低LPS诱导p-p65和p-IκB蛋白水平，结果说明咖啡酸可显著抑制LPS对NF-κB信号通路激活，进一步抑制炎性介质产生，发挥抗炎作用。

图3 咖啡酸对NF-κB信号通路的影响Fig.3 Effects of caffeic acid on the activation of NF-κB signal pathway

2.4 咖啡酸对小鼠乳腺组织MAPKs信号通路的影响

通过检测p38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平，探究咖啡酸对MAPKs信号通路影响，结果如图4所示。LPS刺激小鼠乳腺组织显著激活p38、ERK和JNK蛋白磷酸化，咖啡酸则显著降低LPS诱导的pp38、p-JNK和p-ERK蛋白磷酸化水平，结果说明咖啡酸显著抑制LPS对MAPKs信号通路的激活。

图4 咖啡酸对MAPKs信号通路的影响Fig.4 Effects of caffeic acid on the activation of MAPKs signal pathway

3 讨论与结论

病理学检测结果显示，LPS刺激小鼠乳腺组织可引发炎症反应，乳腺腺泡壁增厚、水肿，腺泡腔中充满大量嗜中性粒细胞，乳腺组织明显充血和淤血，与Hu等研究结果一致[10]。然而，低剂量（10 mg·kg-1BW）咖啡酸处理小鼠乳腺组织腺泡壁变薄，且无水肿现象，充血状况改善；高剂量（20 mg·kg-1BW）咖啡酸处理小鼠乳腺组织恢复正常，结构完整。结果说明咖啡酸可改善LPS刺激小鼠乳腺组织损伤情况。

本试验结果表明，LPS灌注乳腺导管引起小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平升高，与Alhussien等研究结果一致[11]。研究发现，TNF-α是最先产生的炎性细胞因子，可诱导IL-6、IL-8等细胞因子生成；激活血管内皮细胞，协调免疫细胞组织募集并促进组织破坏[12]；刺激嗜中性粒细胞使其向炎症部位聚集发挥作用，加剧炎症反应[13]。本试研究中咖啡酸抑制乳腺炎发生过程中TNF-α过量表达，缓解炎症反应，Zheng等研究表明下调TNF-α过度表达可改善TNF-α诱导病理过程，与本试验结果一致[14]。IL-6和IL-1β在机体免疫调节方面也有重要作用[15]。研究发现，IL-6是LPS诱导机体发烧的基本介质[16]，对白细胞有趋化作用使其进入感染部位，加剧炎症反应过程[17]；IL-1β是一个多功能高度炎性细胞因子，可诱导机体产生大量炎性细胞因子并协同其他炎性细胞因子加剧炎症反应进程[18-19]。本试验结果表明，咖啡酸可抑制LPS诱导小鼠乳腺组织中IL-6和IL-1β过度表达，缓解炎症反应，牟瑞营等研究表明下调IL-6和IL-1β过度表达可改善小鼠乳腺炎症，与本试验结果一致[20]。由此表明咖啡酸可能通过TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子过量产生实现对LPS诱导的小鼠乳腺炎保护作用。

研究发现，NF-κB和MAPKs在炎症反应过程中可介导多种炎性细胞因子活化与释放，是LPS信号转导过程中两条经典路径[21]。静息状态下，NF-κBp65-p50二聚体蛋白与NF-κB抑制蛋白IκB聚合成p65-p50-IκB三聚体，存在于细胞质中，当机体受到LPS刺激时，IκB发生磷酸化反应并降解该三聚体，导致IκB与p65-p50蛋白分离，使NF-κBp65亚基暴露并从细胞质转移到细胞核内，与目的基因结合启动基因转录，导致多种炎性细胞因子表达，诱导机体炎症反应[22]。NF-κB参与IL-1β前体合成[23]。研究表明抑制NF-κB信号通路激活有利于抑制炎性细胞因子产生[24]。本试验结果表明，咖啡酸抑制NF-κBp65和IκB蛋白磷酸化从而抑制NF-κB信号通路激活，减少炎性细胞因子表达，对LPS诱导乳腺炎具有一定保护作用。MAPKs信号通路参与调节炎性细胞因子合成与释放，MAPKs是丝裂原激活蛋白激酶家族，其中p38、JNK、ERK是MAPKs信号通路中重要途径，当机体受外界刺激时，使p38、JNK、ERK发生磷酸化反应激活MAPKs信号通路，启动基因转录促进炎性细胞因子表达，诱导炎症反应[25-26]。本试验结果表明，咖啡酸通过抑制p38、JNK、ERK蛋白磷酸化，抑制MAPKs信号通路激活减少相关炎性细胞因子表达，达到对LPS诱导小鼠乳腺的保护作用。阚兴池研究证明通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路激活可实现对乳腺的保护作用，与本试验结果一致[27]。此外，刘明江证实咖啡酸在细胞水平通过抑制NF-κB和MAPKs通路激活发挥抗炎作用[22]。

本文初步研究咖啡酸对LPS诱导乳腺炎的抗炎机制，结果表明咖啡酸通过降低NF-κBp65和MAPKs通路磷酸化水平发挥抗炎作用。是否存在其他信号通路与咖啡酸发挥抗炎作用尚待深入研究。