一种新型胶原屏障膜在大鼠颅骨极限骨缺损区屏障作用的实验研究

钮春子 王鑫 程浩德 李德华

近年来种植修复已经成为越来越多的缺牙患者的主要修复方式，而临床上可见各种原因导致的种植区骨量不足[1]。引导骨再生技术是临床上用于增加缺牙区骨量的重要技术，其关键在于利用屏障膜保护缺损区的血凝块，阻隔结缔组织，为成骨细胞的迁移和增殖提供一个相对稳定的空间[2]。胶原因其良好的生物相容性、可生物降解，并可促进止血和伤口愈合等优异性能，成为制备屏障膜的理想材料[3-7]。Bio-Gide膜是目前临床上应用广泛的非交联胶原膜，大量研究证实了其在引导骨再生中促进缺损区成骨的可靠性和有效性，但其价格昂贵且降解速率偏快，有专家建议覆盖双层膜以增加其屏障时间。本课题组以小牛皮来源的I型胶原纤维为原料，采用自然成膜的方法制备出一种自主研发的新型胶原膜。通过前期实验研究证实，新型胶原膜具有良好的细胞生物相容性，在体外降解速率缓慢[8]。本实验拟利用大鼠颅骨极限骨缺损模型[9]，进一步研究这一新型胶原膜的引导骨再生作用，为后期的临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料和仪器 I型胶原纤维(常州药物研究所提供)；Bio-Gide膜(Geistlich，瑞士)；环状取骨钻(Stoma，德国)；Micro-CT系统(Inveon,Siemens，德国)；苏木精-伊红染液(南昌雨露实验器材有限公司)。

1.1.2 实验动物 选取无特定病原体级别的SD大鼠(第四军医大学实验动物中心)，雄性，7～8 周龄，体重300～320 g。

1.2 方法

1.2.1 新型胶原膜的制备 采用溶剂挥发法制备胶原膜，具体方法简述为：以国产小牛皮(常州药物研究所)为原料，在提取过程中筛选分子量，去除小分子胶原蛋白，保留长链胶原纤维。通过高速打匀的物理方法将不可溶性的胶原原料于弱酸中形成胶原混悬液，离心除去混悬液中的小分子和气泡。将胶原匀浆置于真空干燥箱中梯度真空干燥，严格控制温度不超过37 ℃以防止胶原变性，形成一种结构致密的新型胶原膜。包装后环氧乙烷灭菌，常温干燥环境下储存备用[8]。新型胶原膜表面较平坦，呈半透明的乳白色。SEM示其结构致密，可见胶原纤维典型的串珠样结构(图1)。

1.2.2 建立大鼠颅骨极限骨缺损模型及实验分组 12 只SD大鼠由1%戊巴比妥钠(0.4 ml/100 g)经腹腔注射麻醉，以矢状缝为中线，在大鼠顶骨左右两侧各制备直径5 mm的圆形缺损，缺损区避开所有骨缝。

实验分为3 组，实验组、对照组和空白对照组，每组4 个样本量。实验组：覆盖新型胶原膜；对照组：覆盖Bio-Gide膜；空白对照组：不覆盖屏障膜。膜的大小为9 mm×7 mm(前后方向超过缺损边缘2 mm)。实验动物及颅骨缺损左右侧别采用随机分配的方式进行分组。

分别于术后4、8 周处死大鼠，每组各2 只，取颅骨及其周围软组织进行检测。

1.2.3 Micro-CT检查及分析 4%多聚甲醛固定样本，设定大鼠CSD区为感兴趣区域，采用高分辨率的Siemens Inveon CT进行扫描。扫描分辨率：19.64 μm。将图像进行三维重建，设置直径5 mm、厚度1 mm的重建区，对CSD区新生骨组织进行计量学分析，具体参数为：骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隙(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)。

1.2.4 组织学HE染色观察 样本经4%多聚甲醛固定、10%EDTA脱钙液脱钙变软后制作石蜡切片，苏木精-伊红染色。为保证各组切片片位相同，切片制取部位为缺损区正中区域同一长轴方向。光学显微镜观察缺损区新骨形成和膜的降解情况。

1.3 统计学分析

2 结 果

12只实验大鼠术后伤口愈合良好。

2.1 SD大鼠颅骨CSD区三维重建结果

术后4周的缺损区三维重建图见图2。实验组和对照组CSD区的边缘和中心区域均可见新骨形成，新生骨组织较薄。而空白对照组的新生骨主要集中于边缘区域。

术后8 周的三维重建图见图2。实验组和对照组的缺损区有明显的新骨形成，新骨的厚度较高、连续性较好、骨桥的结构较完整。空白对照组的新骨形成亦有所增加，但中央区域仍未见明显新骨形成。

2.2 SD大鼠CSD区各骨参数分析

术后在取材修剪样本时不慎将8周的一个样本(实验/空白)毁坏，故8 周的实验组和空白对照组只有3 组数据，其余均为4 组数据。骨参数数据统计结果见图3。

4 周时，实验组的各骨参数与对照组之间无显著差异(P>0.05)。

8 周时，对照组的BV/TV、Tb.N显著地高于空白对照组，Tb.Sp、Tb.Pf显著地低于空白对照组(P<0.05)。实验组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。

图2 SD大鼠CSD区术后三维重建图Fig 2 Three dimensional reconstruction of the CSD after operation

图3 大鼠颅骨CSD区术后4、8 周的新生骨组织各骨参数统计图Fig 3 Statistical analysis of bone parameters in CSD 4 and 8 weeks after operation

2.3 SD大鼠颅骨CSD区组织学观察

术后4周，实验组和对照组的边缘和中央区域均可见新骨形成(图4)。新型胶原膜结构较完整，周围可见少量淋巴细胞(图5A)。Bio-Gide膜结构不清晰，降解显著，周围淋巴细胞和多核巨细胞浸润明显(图5B)。空白对照组新生骨集中在边缘区域，中央部位由结缔组织充填(图4)。

术后8 周，实验组和对照组的缺损区均形成较完整的新生骨组织(图4)。新型胶原膜的结构仍较清晰，膜内可见成纤维细胞和血管生成，淋巴细胞浸润较4 周时增多，可见多核巨细胞(图5D)。Bio-Gide膜进一步降解，结构不可辨认，膜内出现大量血管生成和脂肪组织，可见少量淋巴细胞(图5E)。空白对照组缺损区新生骨组织向中央部位生长，但缺损区仍未获得完全的骨修复(图4)。

3 讨 论

骨再生过程包括血管生成和成骨细胞从缺损区边缘向中心的迁移，以建立一个具有良好血管化的肉芽组织区域，为编织骨的生成和骨质的沉积提供支架作用[10]。缺损区成骨细胞的增殖速率低于成纤维细胞，因此需要利用屏障膜在一定时间内维持缺损区的空间，为成骨细胞提供稳定的再生环境。胶原原料的种类、提取和加工过程、是否使用人工交联等均会影响膜的降解速率[11-13]。本实验以小牛皮的I型胶原为原料，采用自然成膜的方法制备出结构致密的新型胶原膜，将膜植入大鼠缺损区后，膜结构完整性维持的时间、膜内纤维细胞和血管的长入均显著地慢于Bio-Gide膜，提示新型胶原膜的降解速率慢于Bio-Gide膜，这与前期体外实验结果相符[8]。4 周时Bio-Gide膜内可见较多的淋巴细胞和多核巨细胞等炎性细胞，8周时随着膜的降解炎性细胞明显减少；而新型胶原膜则由4 周时的少量淋巴细胞到8周时增多的淋巴细胞和多核巨细胞。外源性的胶原在体内由中性粒细胞、单核/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和成纤维细胞等分泌的基质金属蛋白酶降解[3,14]。在胶原膜的降解过程中伴随着炎性细胞(淋巴细胞、巨噬细胞、多核巨细胞等)的变化，随着胶原膜的降解，炎性细胞由多变少至逐渐消失[5,15]。本实验中两种胶原膜在降解过程中炎细胞的不同变化趋势亦进一步证实新型胶原膜的降解速率缓慢。

NB：新生骨组织；BT：缺损区边界的旧骨；FC：纤维结缔组织；BM：屏障膜图4 大鼠CSD区HE染色图(×40)NB:New bone tissue;BT:Bone tissue by the defect;FC:Fibro-conective tissue;BM:Barrier membraneFig 4 HE staining of CSD(×40)

M：多核巨细胞；L：淋巴细胞；MB：新生骨组织；BM：屏障膜图5 屏障膜周围炎性细胞HE染色图(×200)M:Multinuclear giant cell;L:Lymphocyte;NB:New bone tissue;BM:Barrier membraneFig 5 HE staining of inflammatory cells around the barrier membrane(×200)

机体的绝大多数组织在适宜的条件下可以不需要外力完成自我再生，当缺损过大而不能产生生物力学稳定的中央支架时，骨形成局限于缺损的边缘稳定区域，而中央区域由松散的疏松结缔组织占据[2]。本实验成功建立大鼠颅骨双侧CSD模型，将新型胶原膜覆盖缺损区，术后的三维重建影像和组织学分析显示缺损的边缘和中心区域均有新骨形成、新生骨连续性好，且8 周时形成较完整的骨缺损修复；对比空白对照组，骨再生效果显著。愈合的早期(4 周)，在屏障膜的作用下，缺损区内形成稳定的血凝块，成骨细胞可以快速迁移和增殖，在整个缺损区内形成新骨基质。随着时间的进行，骨基质进一步沉积，形成更加完整和连续的新骨；而无膜覆盖的缺损区内，快速增殖的纤维组织占据大部分区域，新骨形成局限于边缘区。因此，无论是新型胶原膜还是Bio-Gide胶原膜，均成功阻拦成纤维细胞的竞争性增殖，促进缺损区的新骨形成。

本实验以小牛皮为原料，通过自然成膜的方法成功制备出一种新型胶原膜，膜在大鼠体内与周围组织整合良好，降解过程中未引起急性炎症反应。在观察的8 周内膜在大鼠体内发挥良好的屏障作用，显著地促进缺损区骨再生。新型胶原膜在大动物体内的远期屏障作用有待后续实验进一步研究。

4 结 论

覆盖新型胶原膜可以促进大鼠颅骨CSD区新骨形成，新型胶原膜在大鼠体内的降解速率显著地慢于Bio-Gide膜，可能发挥更持久更完整的屏障作用。