膀胱癌免疫基因组学分型及其临床意义

王尧 巴宏军 柳子川 周旻 周启明

1广州医科大学附属肿瘤医院内二科（广州510095）；2中山大学附属第一医院心血管儿科（广州510080）；3华中科技大学协和深圳医院南山肿瘤中心（深圳518052）

膀胱癌是泌尿系统第二常见的恶性肿瘤，全世界每年有38 万新发病例，其中约15 万人死亡［1-2］。非肌肉浸润性膀胱癌经手术治疗预后良好，而肌肉浸润性膀胱癌患者极易复发及转移，是膀胱癌相关死亡的主要原因［3-4］。膀胱癌的发生与炎症和免疫细胞浸润密切相关，卡介苗、癌症疫苗及免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）等免疫治疗在膀胱癌中取得了良好的疗效［5-7］，但抗PD-1 抗体治疗晚期膀胱癌的单药有效率仅波动在20% ～30%之间［8］。因此结合免疫相关因素及病理分型对膀胱癌患者进行风险分层有助于判断预后及治疗反应。随着基因组技术和高通量分析的发展，基因检测已成为精准医疗的重要组成部分，我们采用免疫基因组学分析将膀胱癌分为三型，并进一步分析各型的免疫特征，旨在通过本研究为判断患者的预后和治疗反应提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据采集本研究从TCGA 数据库下载了409 例膀胱癌患者肿瘤和正常组织的基因表达谱及相应临床数据。纳入研究的患者没有特殊的排除标准，每个肿瘤组织对应一个患者。资料采集时间为2019年8月1日。

1.2 聚类分析按照免疫基因组功能定义29 个免疫标志的基因集［9］，通过ssGSEA 来量化每个膀胱癌样本中基因集的富集水平并排序［10］。采用Elbow 法和Gap 统计量相结合的方法，决定聚类的分组数量并进行聚类分析［11］。

1.3 肿瘤成分评估采用CIBERSORT 分析工具通过反褶积算法推断不同样本中22 种肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cells，TIICs）的组成比例［12］。使用ESTIMATE（estimation of STromal and immune cells in MAlignant tumors using Expression data）方法评估各个样本的免疫评分、基质细胞含量及肿瘤纯度［13］。

1.4 GO 和KEGG 富集分析利用R 软件中clusterProfiler 包［14］将获得的表达矩阵在高免疫组和低免疫组中进行基于基因本体论（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）的富集分析，判断两组主要的功能类别及信号通路定位。

1.5 统计学方法通过Kaplan-Meier 曲线分析各个亚组的生存率，并采用log-rank 法进行检验。所有分析均使用R 软件（3.5.2 版本）进行，所有统计均为双侧检验，P＜0.05 定义为有统计学差异。

2 结果

2.1 病例特征本研究共纳入409 例膀胱癌患者，其中男303 例（74.1%），女106 例（25.9%），平均年龄为68.1 岁（34 ～90 岁）。临床资料包括年龄、性别、肿瘤分级、T 分期、淋巴结受累、转移情况（表1）。

2.2 免疫分型及免疫评分采用ssGSEA 分析29个免疫相关基因集［9］来量化膀胱癌样本中免疫细胞、功能或相关通路的活性及富集水平并进行评分［9］，通过评分进行聚类分析并将患者分为高、中、低免疫组。3 组间生存率具有统计学差异（P= 0.004），高免疫组的生存率明显预后优于其他两组（图1）。ESTIMATE 分析发现从低免疫组到高免疫组，免疫评分及基质评分逐渐增加，而肿瘤纯度逐渐降低，3 组间具有统计学差异（P＜0.001）（图2）。

表1 409 例膀胱癌患者的临床病理特征Tab.1 Baseline characteristics of 409 patients with bladder cancer

2.3 免疫分型与HLA及单基因的相关性从低免疫组到高免疫组，大部分HLA基因的表达水平逐渐升高，各组间具有统计学差异（图3A）。单基因分析发现从低免疫组到高免疫组，PD-L1、CTLA-4 表达逐渐升高（图3B）。

2.4 免疫分型中TIICs 分布及基因富集分析通过CIBERSORT 分析发现有8 种TIICs 在各组间具有统计学差异，从低免疫组到高免疫组CD8+ T 细胞逐渐增多，而M0 巨噬细胞和未活化的记忆性CD4+T 细胞逐渐减少（图4）。GSEA 分析发现高免疫组中显著上调的GO 集合及KEGG 信号通路主要富集在免疫相关功能方面（表2）。

图1 膀胱癌各免疫分型的生存曲线Fig.1 Survival curves of different immune groups of bladder cancer（log-rank test）

3 讨论

肿瘤的发生、发展过程与宿主的免疫系统密切相关，免疫系统具有识别和消灭肿瘤细胞的功能，但是肿瘤细胞能够通过免疫逃逸和免疫抑制躲避免疫系统的监控，目前免疫治疗主要包括克服肿瘤的免疫耐受以及激活效应细胞的杀伤作用。既往研究［15-18］发现，在三阴乳腺癌、结肠癌、头颈部鳞癌等多种肿瘤中通过对免疫特征进行评估而制定的免疫分型有助于指导治疗及改善患者的临床预后。本研究通过分析TCGA 数据库获得的基因表达数据，对膀胱癌患者进行免疫分型，并进一步分析了各型的免疫特征与预后之间的关系。

图2 膀胱癌基于免疫基因组学的分型及ESTIMATE 分析Fig.2 Classification of bladder cancer based on Immunogenomic profiling and ESTIMATE analysis

ICIs 的疗效有赖于肿瘤的免疫原性，目前预测PD-1 抗体疗效的标志物主要包括：肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）、肿瘤细胞PD-L1 表达水平、肿瘤突变负荷、错配修复缺陷/微卫星高度不稳定等［19］。肿瘤微环境是指肿瘤在其发生、发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、微淋巴管、组织液、众多细胞因子及少量浸润细胞等共同构成，肿瘤微环境在PD-L1 的调节中起着重要作用，其构成与ICIs 疗效密切相关［20］。本研究通过ESTIMATE 分析肿瘤微环境发现高免疫组包含的免疫细胞和基质细胞数量最多，并且大部分HLA 基因高表达，与其他两组相比具有更强的免疫原性，同时单基因分析发现高免疫组的PD-L1 表达明显高于其他两组，提示高免疫组更适合于免疫治疗。

图3 各免疫分型中HLA 及PD-L1、CTLA-4 的基因表达水平及组间差异Fig.3 Comparison of HLA gene expression and PD-L1/CTLA-4 level between immune groups（ANOVA test，***P ＜0.001）

图4 免疫分型与肿瘤浸润免疫细胞的相关性分析Fig.4 Comparison of TIICs levels between different immune groups

表2 高免疫组中显著上调的GO 功能集合和KEGG 信号通路Tab.2 Significantly enriched GO terms and KEGG pathways of Immunity H group

肿瘤微环境常常能够抑制活化的T 细胞进入肿瘤组织或阻止效应T 细胞的活化，TIL 数量与患者的预后密切相关［21］。研究［22］表明，CD8+T 细胞作为消除肿瘤的重要效应T 细胞，有助于延长患者的总生存及提高免疫治疗的疗效。肿瘤相关巨噬细胞能够表达抑制T 细胞募集和活化的细胞因子和酶，从而增强对免疫检查点抑制剂的耐药性，目前正在进行的众多临床实验旨在抑制巨噬细胞的增殖或极化，以增强抗肿瘤免疫应答［23］。与先前研究一致，笔者发现高免疫组的预后最好，其中CD8+T 细胞含量最高，而M0 巨噬细胞最少。通过GO 和KEGG 富集分析发现，高免疫组的功能主要富集在MHC Ⅱ类蛋白复合物、MHC 蛋白复合物及抗原处理和递呈等免疫相关功能上。以上结果进一步证实了高免疫组具有较高的抗肿瘤免疫活性。

综上所述，高免疫组的膀胱癌患者预后最好，并且具有较高的免疫原性及抗肿瘤免疫活性，或许更加适合采用ICIs 治疗。基于免疫基因组学的膀胱癌分型有助于临床医师判断患者的预后、选择优势治疗人群及进一步制订个体化的免疫治疗方案。然而作为一项探索性的研究，该分型在膀胱癌中的应用价值有待于多中心大样本的临床研究验证。