沉默miR-375对非酒精性脂肪性肝病发生发展的作用及机制探究

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除乙醇及其他明确肝损伤因素外所引起的，以肝脏实质细胞脂肪变性为病理特征的临床病理综合征[1]。近年来，随着人们生活水平不断提高，生活方式及饮食结构发生变化，使中国NAFLD的发病率逐年升高，严重危害着公众健康[2]。及时对NAFLD进行干预，可有效抑制其进展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化或肝硬化。目前临床尚未有治疗NAFLD的特效药物，主要治疗方式是对生活及饮食进行干预，并给予阿托伐他汀、奥利司他等药物治疗。因此，阐明NAFLD的发病机制并开发相应的靶向药物，对于治疗NAFLD具有重要意义。多数学者认为，肠源性内毒素过多导致的氧化应激与NAFLD的发病关系密切[3]。Toll样受体4(TLR4)是激活内毒素信号转导通路的受体[4]。有研究指出，miR-375可靶向TLR4诱导核因子κB活化，参与炎症性肠病的发生过程[5]。本文探究了沉默miR-375对NAFLD发生发展的作用及其机制，现报道如下：

1 动物与方法

1.1 实验动物

36只SD大鼠[北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK(京)2009-0004]，SPF级，适应性饲养1周，期间给予充足的水和普通饲料，控制昼夜交替周期为12 h。实验操作遵从2006年科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试剂与仪器

4%多聚甲醛、60%异丙醇、TBST缓冲液、化学发光液、油红O染色试剂盒、TLR4、GAPDH抗体和BCA蛋白定量测定试剂盒均购自北京孚博生物科技有限公司，天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-8检测试剂盒均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自瑞士罗氏公司，1658001型垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司，SLAN-96S型PCR扩增仪购自上海宏石医疗科技有限公司，DYCP-31C型琼脂糖水平电泳仪购自北京六一生物科技有限公司，7020型全自动生化分析仪购自日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及模型构建 在36只SD大鼠中，随机选取28只构建NAFLD大鼠模型，高脂饲料饲养12周[6]，之后随机选取4只大鼠处死，取其肝组织，采用油红O染色方法判断NAFLD大鼠造模成功与否。将造模成功的24只大鼠随机分为模型组(B组)、空载体组(C组)和沉默组(D组)，每组各8只。分别于饲养第13周和第18周时，C组尾静脉注射含空载质粒的慢病毒，D组尾静脉注射含si-miR-375质粒的慢病毒，B组不做任何处理。将未进行造模处理的8只大鼠设为正常组(A组)。

1.3.2 肝脏功能、血脂及炎性因子水平检测 各组大鼠禁食12 h后，心脏取血，3 500 r/min离心10 min，提取上层血清，冷冻保存，待验。采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清AST、ALT、TC、TG、TNF-α、IL-6和IL-8的表达水平。

1.3.3 肝组织病理学观察 采用油红O染色观察各组大鼠肝组织的病理学变化[7]。取新鲜肝组织，液氮中冷冻，并用组织切片机切成约8 μm厚度的切片，4%多聚甲醛固定，然后用60%异丙醇处理，油红O染色15 min，60%异丙醇分化，苏木素复染，甘油明胶封片。

1.3.4 miR-375相对表达量检测 采用RT-qPCR法检测各组肝组织中miR-375的相对表达量[8]。具体步骤如下：用TRIzol试剂提取肝组织中总RNA，采用逆转录酶法将总RNA转化成cDNA，然后用PCR扩增仪进行扩增反应。扩增条件：94 ℃预变性2 min，之后94 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.3.4 肠组织中TLR4水平检测 采用蛋白质免疫印迹法检测各组肠组织中TLR4水平[9]。具体步骤如下：取适量肠组织，加入组织蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，静置30 min后离心取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。然后依次进行电泳、转膜及5%脱脂牛奶封闭过程，滴加TLR4、GAPDH一抗孵育过夜。次日TBST缓冲液漂洗，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST缓冲液漂洗，加入化学发光液。以GAPDH为内参，用ImageJ 1.8.0软件进行分析。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组肝组织病理学改变

A组大鼠肝细胞内无明显脂肪堆积，B组大鼠肝细胞内存在大量脂肪堆积，C组与B组相似，D组大鼠肝细胞内无明显脂肪堆积，脂质累积情况相较于B组显著改善。见图1。

2.2 各组肝组织中miR-375相对表达量比较

A、B、C和D组肝组织中miR-375相对表达量分别为1.04±0.23、2.56±0.52、2.48±0.38和0.81±0.14。与A组比较，B组肝组织中miR-375相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组肝组织中miR-375相对表达量降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图1 各组肝组织病理学改变 油红O染色 ×100 A 正常组 B 模型组 C 空载体组 D 沉默组

2.3 各组肝脏功能、血脂水平比较

与A组比较，B组AST、ALT、TC和TG表达水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组AST、ALT、TC和TG表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组AST、ALT、TC和TG表达水平比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

2.4 各组炎性因子水平比较

与A组比较，B组TNF-α、IL-6和IL-8表达水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组TNF-α、IL-6和IL-8表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.5 各组肠组织中TLR4水平比较

A、B、C和D组肠组织中TLR4相对表达量分别为0.34±0.08、0.87±0.13、0.88±0.15和0.11±0.03。与A组比较，B组肠道组织中TLR4相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组肠组织中TLR4相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

表3 各组TNF-α、IL-6和IL-8表达水平比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

图2 各组肠组织中TLR4的相对表达量

3 讨论

本研究采用高脂饲料饲养方式构建NAFLD大鼠模型，通过油红O染色观察肝组织病理学改变，结果显示NAFLD模型大鼠肝组织中脂肪堆积严重，提示NAFLD大鼠造模成功。随后进一步采用RT-qPCR法检测各组肝组织中miR-375相对表达量，结果显示D组miR-375相对表达量低于B组和C组，提示沉默miR-375成功。

微RNA(miRNA)是一类由18～22个核苷酸组成的RNA，不具有编码蛋白质的功能，但在细胞增殖、凋亡、分化等过程中发挥着重要作用[10]。近年来研究表明，miRNA可参与NAFLD的发病和进展过程[11-13]。miR-375作为miRNA中的一员，已被证实参与了胃癌[14]、肝细胞癌[15]、宫颈癌[16]及前列腺癌[17]等的发生、发展过程，但有关miR-375与NAFLD发病关系的报道较少。本文探究了miR-375的表达水平与NAFLD的关系，以期阐明NAFLD的发病机制，为NAFLD的靶向药物的研制提供参考。

本研究结果显示，D组的AST、ALT、TC、TG、TNF-α、IL-6、IL-8和TLR4水平均低于B组和C组，提示沉默miR-375可降低NAFLD大鼠血脂及炎性因子水平，降低炎性反应程度，改善肝功能。NAFLD的发病机制尚未被阐明，有研究认为其与肠源性内毒素过多导致的氧化应激有关[3]，而肠-肝轴在其中发挥着重要作用。当机体肠-肝轴存在功能紊乱时，肠黏膜通透性增加，致使细菌及相关代谢产物随门静脉进入肝脏，诱发氧化应激反应，从而加重肝脏炎性反应[18]。TLR4是参与机体非特异性免疫的一种重要蛋白，其可以与内毒素结合而激活细胞内信号通路，分泌TNF-α、IL-6等炎性因子[19]。正常情况下，机体肠黏膜细胞不表达或低表达TLR4，从而维持对内毒素的不敏感性，进而避免内毒素对肠黏膜细胞的损伤。此外，还有研究证实肠道上皮细胞中存在TLR4受体的小鼠相较于不存在TLR4受体的小鼠更易在高脂饲养状态下患NAFLD[20]。本研究通过蛋白质免疫印迹法检测各组肠组织中TLR4的水平，结果显示D组TLR4水平低于B组和C组，提示沉默miR-375可抑制NAFLD大鼠肠组织中TLR4的表达，进而改善肝功能，调节血脂及炎性因子水平。

综上所述，沉默miR-375对高脂饲养诱导的NAFLD大鼠有一定的保护作用，可降低NAFLD大鼠的血脂、TNF-α、IL-6和IL-8水平，改善肝脏功能，其机制可能与调控肠组织中TLR4表达有关。瘦素和瘦素受体及其下游信号通路、磷酸腺苷激活蛋白激酶信号通路及固醇调节元件结合蛋白2信号通路均与NAFLD的发病关系密切，今后将进一步探究miR-375表达水平对上述通路的影响，以期阐明miR-375与NAFLD的关系。