核受体Nur77对卵巢癌细胞增殖转移的影响及机制研究

姜 平 杨喜科 王秋宇

在妇科恶性肿瘤中卵巢癌的发生率和病死率均位居前列，早期的卵巢癌症状并不明显，较少出现急性腹痛，且易与卵巢滤泡囊肿、黄体囊肿、阔韧带肌瘤等其他疾病引起的症状混淆，因此不少缺乏体检的患者在确诊时肿瘤已进入晚期并发生转移，包括蔓延至输卵管、子宫、腹膜，严重时可进犯到结肠内发生梗阻，或者通过淋巴和血液循环发生远端转移，此时患者身体状况日益虚弱，各类药物疗效不佳，导致生存率急剧下降。因此，研究卵巢癌侵袭转移的机制，以此作为评价病情的指标，并为研制药物提供作用靶点，是提高卵巢癌晚期患者生存率的有效手段[1]。

Nur77为孤儿受体超家族蛋白，在各种组织，在肺癌、胃癌、结肠癌和肉瘤等肿瘤中常存在过度表达，且对肿瘤细胞生长、增殖、侵袭、转移均起到促进作用[2]。有研究报道，Nur77在卵巢上皮性癌组织中的表达明显高于良性卵巢肿瘤、交界性肿瘤及正常的卵巢组织，而且表达水平随着临床病理分期的增加而上升，且随访发现Nur77阳性的患者术后3年的复发率明显增加，确诊时均为晚期且伴有转移，提示Nur77可能与卵巢癌的复发和转移密切相关[3]。有细胞研究表明，在SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO等多种卵巢癌细胞中，具有高转移性的HO-8910-PM细胞存在Nur77高表达[4]。据此，本研究以人高转移性卵巢癌细胞HO-8910PM为研究对象，通过下调Nur77表达量或激活其活性，研究Nur77在卵巢癌发生侵袭转移过程中所产生的作用和病理机制。

材料与方法

1.材料：(1)药品与试剂：壳囊孢酮 B(美国Sigma-Aldrich公司)，Lipofectamine 2000转染试剂、高糖DMEM培养基、特级胎牛血清、0.25%胰酶溶液(美国Gibco公司)，annexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，GAPDH、p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等兔抗人一抗以及羊抗兔二抗(英国Abcam公司)。TBST缓冲液、Triton X-100溶液、MMP-2、MMP-7、MMP-9 ELISA试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，Transwell试剂盒(美国Corning公司)，pLV-U6-MCS-GFP-Puro(型号：LV008)慢病毒转染载体试剂盒、M-MLV反转录酶、GoTaq®qPCR试剂盒、嘌呤霉素(美国Promega公司)，shNur77干扰序列 5′-AACTCCAAGTTGGACTATTCCTTAAGTTCTCTAAG GAATAG TCCA ACTTGGTTTTTTC-3′(美国Invitrogen公司)。(2)仪器:Thermo Forma 3951 细胞培养箱、Sorvall ST 40台式离心机(美国Thermo 公司)，FACS Calibur 型流式细胞仪(美国BD公司)，iMark 680酶标仪、Western blot转膜仪(美国Bio-rad公司)，IX71 倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。(3)细胞:人高转移性卵巢癌细胞HO-8910PM、293T细胞株(美国ATCC生物资源中心)，Tran5α感受态细胞(法国Transgene公司)。

2.方法：(1)细胞的培养：将细胞接种于含10% FBS, 100U/ml青霉素，0.1g/L硫酸链霉素的高糖 DMEM培养基中，在37℃、饱和湿度、5% CO2、95% 空气的细胞培养箱中培养。待细胞生长覆盖约至 80%时，用0.25%胰酶消化传代，并按5×104个/毫升密度接种于培养板或培养瓶内备用。(2)干扰质粒的克隆:将正、反义寡核苷酸链和反应缓冲液各1μl加进17μl 纯化水，加热至95℃，10min后自然冷却至室温。在37℃加入T4磷酸化酶作用30min使寡核苷酸链的5′端磷酸化。将LV008载体、寡核苷酸双链、连接反应缓冲液、T4连接酶各1μl 加入6μl 纯化水，室温反应30min。冰浴中将50～100ng连接产物分别加入至50μl Tran5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90s。快速将管转移至冰浴中，冰浴2min。分别加入500μl LB培养基，37℃、150r/min振荡培养40min。将150μl菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。(3)慢病毒包装:转染前将培养好293T的细胞培养基更换为无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pLV-gene载体10μg，pGag/Pol载体5μg、pRev载体5μg、pVSV-G载体5μg)，与相应体积的Opti-MEM 混合均匀，调整总体积为 1.5ml。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000 进行混合，在室温孵育20min后，液转移至293T细胞的培养液中细胞培养箱中，6h后更换含血清培养基继续培养48h。收集转染后的293T 细胞上清液，于 4℃，4000×g离心10min，除去细胞碎片。把病毒液样品加进滤杯插到滤过液收集管中，5000×g离心15min，至浓缩病毒样品的体积。将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃保存1周，或-80℃长期保存。(4)干扰稳定细胞系的构建:从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鲜的完全培养基稀释成所需浓度，准备好HO-8910PM 细胞，研究组加入shNur77干扰序列载体，对照组加入慢病毒空载体，加入聚凝胺 37℃培养过夜。第2天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续培养。第3天，换上含适当浓度嘌呤霉素的培养液，筛选稳定转导的细胞株。10～12天后可获得稳定表达目的蛋白的细胞克隆。荧光显微镜下拍照观察GFP阳性率>95%。(5)细胞的分组处理：按不同的实验细胞和处理方式设对照组、研究组、Csn-B组、Csn-B(Nur77-/-)组共4个组别进行研究，详见表1。(6)细胞周期的检测：将细胞接种于6孔板中培养，分组处理24h，弃去培养液，PBS洗涤后加入用0.25%胰酶(不含EDTA)于37℃进行消化，然后加入500μl 75%的预冷乙醇，4℃固定过夜，预冷PBS洗涤后离心，吸弃上清液，加入100μl RNase A，37℃水浴30min，加入PI染液400μl，4℃避光保存30min，流式细胞仪上检测细胞周期。(7)蛋白表达量的检测:在6孔板中将培养好的细胞分组处理24h，用PBS 冲洗2次，加入预冷细胞裂解液作用30min， 12000r/min 4℃离心15min，沉淀细胞碎片等杂质，取上清液，BCA法测定蛋白量。用含12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，5%BSA封闭90min，加入稀释好的一抗，在4℃条件下孵育过夜。TBST洗膜后，加入二抗，37℃孵育1h，再洗涤2次，ECL试剂暗室显影，采用成像系统软件分析胶片中条带的灰度面积，以内参GAPDH基准计算各待测蛋白的相对表达量。(8)基质金属蛋白酶的检测:在6孔板中将培养好的细胞分组处理24h，吸取上清液，3000×g离心10min去除细胞残屑，按试剂盒说明书操作检测，以对照组为参照，比较各药物组细胞培养液中MMP-2、MMP-7、MMP-9的相对分泌量。(9)细胞转移和侵袭力的检测:将对数生长期的细胞10cm接种于培养皿中，分组处理24h。将Transwell小室架于配套的24孔板上，按1∶7比例将50mg/L Matrigel胶与无血清DMEM培养液混合均匀，取100μl加至小室中央，置于37℃培养箱中孵育6h，然后弃去残余液体。将细胞按2×105个/孔接种至Transwell小室内，下小室加入800μl含10%胎牛血清DMEM培培养24h后，弃去培养液，无水乙醇固定细胞10min，0.1% 结晶紫染色30min，洗涤后在显微镜下观察，随机统计从中间和四周5个视野的细胞数，求其平均值及标准差。

表1 细胞的分组处理

结 果

1.慢病毒载体的转染:从图1A 可观察到对照组和研究组的细胞在荧光显微镜下均可观察到标记蛋白GFP的绿色荧光，两组的荧光强度比较差异无统计学意义；图1B可见对照组Nur77的WB显影条带与研究组比较明显较深；图1C柱状图所示研究组的Nur77相对表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明慢病毒载体已转染成功，已达到下调 Nur77表达量的目的。

图1 慢病毒载体转染HO-8910PM 细胞A.转染后对照组与研究组的荧光成像(×200)；B.转染后对照组与研究组Nur77的WB显影条带；C. 转染后Nur77的相对表达量比较;与对照组比较，*P<0.05

2.细胞周期分布的检测：流式细胞法检查各组细胞在不同细胞周期的数量分布，如图2A所示，图中红色部分表示细胞处于G0和G1期，黄色部分表示处于S期，蓝色部分表示处于G2期和M期。图2B所示为处于各个周期的细胞数量百分比， S、G2和M期的比例依次为：研究组

3.p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1含量的检测：WB的显影条带如图3A所示， p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1的三者含量呈正相关变化，含量依次为研究组

图2 各细胞周期的细胞数量比例A.流式细胞法检测细胞周期；B.处于不同周期的细胞数量比例；与对照组比较，*P<0.05;与研究组比较，#P<0.05

图3 WB检测p-Nur77、p-Akt、Cyclin D1的表达量A.各蛋白的WB显影条带；B.各蛋白相对表达量的比较;与对照组比较，*P<0.05；与研究组比较，#P<0.05

4.细胞转移相关蛋白含量的检测：WB的显影条带如图4A所示，E-cadherin的含量依次为研究组> Csn-B(Nur77-/-)组>对照组>Csn-B组，而N-cadherin和Vimentin的含量则与之相反，依次为研究组

图4 WB检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的含量A.各蛋白的WB显影条带；B.各蛋白相对表达量的比较;与对照组比较，*P<0.05；与研究组比较，#P<0.05

5.MMPs分泌量的检测：ELISA检测结果如图5所示，MMP-2、MMP-7和MMP-9的相对含量依次为研究组

图5 MMP-2、MMP-7和MMP-9分泌量的比较与对照组比较，*P<0.05；与研究组比较，#P<0.05

6.细胞转移侵袭能力的检测：图6A所示为穿过Transwell小室转移至培养板孔内的细胞；图6B所示为采用目镜微尺的细胞计数结果，培养板孔内的细胞数量依次为研究组< Csn-B(Nur77-/-)组<对照组< Csn-B，与对照组比较，各药物组细胞数量差异均有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

目前发现的在人孤儿核受体(orphan nuclear receptor)有25个成员，之所以成为孤儿受体，是因为它们特异性的体内配体至今仍未确定。Nur77 (也称为TR3或NGFI-B)就是其中1个孤儿核受体，其定位于人12号染色体, 由NR4A1编码, 是类固醇/甲状腺受体/视黄酸受体超家族成员。NR4A家族包含3个成员，即Nur77(NR4A1)、Nurr1(NR4A2)和Nor-1(NR4A3), 它们在结构上都具有典型的核受体特征。在人乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌等各种恶性肿瘤中均存在Nur77高表达，提示Nur77可能参与肿瘤的发生、发展过程。研究表明，各种有丝分裂原都可以显著提高Nur77的蛋白表达，表皮生长因子、血清等促有丝分裂刺激物能够强烈地诱导Nur77表达, 从而促进细胞增殖。转染外源Nur77质粒能够加速细胞周期进程, 增加S/G2期的细胞数量, 而抑制内源Nur77表达水平则明显抑制肿瘤细胞的增殖速度。Nur77高水平表达是许多肿瘤生长、增殖、转移和侵袭的关键因素之一[5]。

图6 Transwell法检测细胞的转移侵袭能力A.转移至培养板孔内的细胞(×200)；B.细胞计数结果的比较;与对照组比较，*P<0.05；与研究组比较，#P<0.05

Nur77在卵巢上皮性癌组织中的表达明显高于良性卵巢肿瘤、交界性肿瘤及正常的卵巢组织，而且表达水平随着临床病理分期的增加而上升，提示Nur77可能与卵巢癌的转移和侵袭密切相关。卵巢癌的转移包括以下4种方式：(1)直接转移：当肿瘤发展到与周围的组织器官发生黏连，可直接蔓延至输卵管、子宫、腹膜，严重时可进犯到结肠表面。(2)植入转移：当肿瘤细胞不断增殖穿破包膜，脱落并扩散至腹腔或盆腔内，进而依附腔内脏器继续生长。(3)淋巴转移：卵巢癌可通过卵巢门血管转移到腹主动脉旁淋巴结和腹股沟淋巴等组织。(4)血性转移：通过血液循环系统转移至肺部、肝脏、骨等部位，各种方式的转移和侵袭均涉及到肿瘤细胞的迅速增殖，细胞形态转变以及产生各种能够分解正常组织基质的分子，包括各类基质金属蛋白酶(MMPs)[6]。

Cyclin D1是细胞周期蛋白中最重要的一员，Cyclin D1过度表达可使细胞增殖失控，迅速从G1期进入S期，进而促进肿瘤细胞的存活、生长、转移和代谢因而其在肿瘤学研究领域常作为一个观察肿瘤细胞增殖状况的有效指标[7，8]。研究表明Cyclin D1的表达受到上游PI3K/Akt通路的调控，当Akt经过第二信使PI3K磷酸化生成p-Akt后，可延长下游的信号通路蛋白Cyclin D1的半衰期，从而促使细胞增殖加快乃至发生癌变[9]。有研究者通过细胞实验发现在乳腺癌细胞中Nur77可介入PI3K/Akt的调控，干扰Nur77的表达可对PI3K/Akt通路产生抑制作用而促进肿瘤细胞凋亡[10]。本研究结果显示，下调HO-8910PM细胞Nur77的表达量可抑制Akt的磷酸化激活，降低Cyclin D1的表达，遏制细胞周期的进展，最终抑制HO-8910PM细胞的生长和增殖[11]。

上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是上皮源性肿瘤发生转移的首要阶段，在极性上皮细胞逐渐向间质细胞表型转化的过程中, 细胞的迁移、侵袭能力不断加强，主要发生机制为不同亚型钙黏附蛋白(cadherin)之间的转换[12]。其中E-cadherin是维持上皮细胞之间的连接黏附，保持细胞聚集功能的主要分子，因而在正常细胞组织中保持高水平表达，若其表达水平降低，则可导致细胞复合体解离; 而cadherin 另一个亚型N-cadherin 的作用则与之相反，其在某些生长因子的作用下可使细胞复合体解离，在肿瘤细胞侵袭、浸润、转移的过程中起到促进作用[13,14]。波形蛋白(Vimentin)是中间丝蛋白家族的主要成员，其多聚体是与肌动蛋白和微管蛋白共同构成细胞骨架蛋白的关键成分，研究发现在癌细胞侵袭和迁移的过程中，游离Vimentin含量的不断增加，意味着细胞骨架蛋白发生解离，是EMT开始进展的信号[15]。本研究结果表明，下调HO-8910PM细胞中Nur77的表达量可抑制E-cadherin向N-cadherin的转化，并维持Vimentin的稳定，从而抑制卵巢癌细胞的侵袭与转移能力[16,17]。

MMPs 是一个能够降解和重塑细胞外基质的蛋白水解酶家族，在正常组织中的表达和活性相对较低，但在发生炎性反应、骨质疏松、肿瘤侵袭转移等病变的时候，其含量均会显著增加。大量临床研究表明鼻咽癌的转移与MMPs的过度表达分泌密切相关，包括MMP-1、2、7、9、13、14等众多家族成员，涉及细胞间质、基膜胶原蛋白的降解以及骨质的侵蚀[18]。在各种 MMPs 成员中MMP-2、MMP-7和MMP-9与卵巢癌发生侵袭转移的关系最为密切，它们主要降解的底物为Ⅳ型胶原、明胶、弹力蛋白等组织基膜的主要成分，而基膜的降解是肿瘤细胞进行侵袭与转移首要阶段[19]。因此本研究选用MMP-2、MMP-7和MMP-9作为检测指标，并选用富含层黏连蛋白、Ⅳ型胶原的Matrigel胶作为Transwell实验培养皿的基质进行研究。本研究结果表明，下调HO-8910PM细胞Nur77的表达量，培养基中的MMP-2、MMP-7和MMP-9含量显著逐渐减少，结合Transwell实验结果分析，下调Nur77的表达量能够抑制HO-8910PM细胞分泌MMP-2、MMP-7和MMP-9,降低其侵袭转移的能力。