溃疡性结肠炎患者中诱骗受体和护骨素基因多态性及其结肠组织表达水平分析

邵晓晓 金颖莉 林芊如 闵全佳 朱浩奇 蒋 益

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性肠道炎症，主要累及结肠黏膜和黏膜下层，范围多自远端结肠开始，可逆行向近端发展，甚至累及全结肠及末端回肠，病灶多呈连续性分布。流行病学数据显示，UC的全球发生率不断升高，我国亦是逐年增加[1]。UC的确切病因和发生机制至今尚未阐明，而且由于缺少特异性的治疗手段和药物，UC患者的病情常迁延、反复，不仅严重影响患者的生活质量，也给家庭和社会带来沉重的负担。

细胞凋亡(apoptosis)是调控机体正常发育、维护内环境稳定的重要生理过程，研究证实细胞凋亡失调在UC的发病中占有十分重要的地位，肠黏膜上皮细胞凋亡过度，黏膜固有层淋巴细胞(LPT)凋亡抵抗和凋亡迟滞，是导致肠组织炎性反应发生和持续的重要原因[2]。研究发现在UC炎症局部及其邻近区域，整个结肠隐窝上皮细胞均有凋亡现象。用多种凋亡标志物检测UC和正常结肠上皮细胞凋亡的程度和范围，发现活动性UC病变区域上皮细胞凋亡发生的程度和范围都高于正常组织[3]。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis- inducing ligand, TRAIL) 能激活外源性凋亡途径，促进细胞凋亡。研究证实TRAIL与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis, AIT)等疾病相关[4～7]。TRAIL主要通过与死亡受体(death receptor, DR)4或DR5结合，产生促细胞凋亡信号，诱导靶细胞凋亡。除DR4、DR5外，TRAIL受体家族还包括诱骗受体(decoy receptor, DcR)1、DcR2及护骨素(osteoprotegerin, OPG)。TRAIL与死亡受体结合，通过天冬氨酸蛋白水解酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8, caspase-8)和Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain, FADD)途径转导凋亡信号，但DcR1缺乏跨膜区及胞内域，DcR2仅含有截断的死亡结构域，OPG缺乏功能性的死亡结构域，因此这3种受体与TRAIL结合后不仅不产生细胞凋亡信号，还与DR4或DR5竞争性结合TRAIL，抑制靶细胞凋亡。

本研究组前期初步探讨了TRAIL基因3′非翻译端 (G1525A、G1588A、C1595T)3个SNPs和血浆sTRAIL水平以及死亡受体DR4、DR5基因多态性与中国汉族人群UC易感性的关系，结果发现UC患者中TRAIL(G1525A、G1588A、C1595T)位点的突变率明显高于对照组，提示这3个SNP的突变对UC具有保护作用，可能是影响UC易感性的潜在功能性位点[8]。进一步研究发现DcR2(rs1133782位点)基因多态性可能影响UC的易感性，OPG(rs3102735)基因突变不仅会增加UC的患病风险，还可能影响UC的疾病严重程度[9]。但由于TRAIL的生物学效应受多种因素的影响，尤其是与TRAIL受体家族的表达或功能密不可分，因此本研究将进一步探讨结肠组织中DcR1、DcR2和OPG的表达水平与UC的关系，旨在为揭示UC的遗传免疫学机制提供线索。

对象与方法

1.研究对象:收集2018年3月～2019年4月温州医科大学附属第二医院消化住院和门诊确诊的UC患者56例，其中男性26例，女性30例，患者平均年龄38.42±15.24岁。同期于温州医科大学附属第二医院消化内科收集的性别、年龄相匹配的良性结肠息肉患者62例(男性30例，女性32例)，患者平均年龄37.56±16.36岁。依据中华医学会消化病分会制定的“炎症性肠病诊断与治疗的共识意见”[10]，经临床、实验室、胃镜、结肠镜、小肠镜或胶囊内镜、放射影像学及病理组织学等检查综合确立UC诊断，所有纳入研究的病例均为初发型UC。依据结肠镜表现将UC疾病部位分为远端结肠炎 (E1+E2，31例) 和广泛结肠炎 (E3，25例)。依据“改良的Truelove & Witts评分”将UC疾病严重程度分为轻度(23例)、中度(28例)和重度(5例)[11]。所有UC病例纳入前经各项检查排除感染性腹泻、缺血性肠病、放射性肠炎、消化道肿瘤、糖尿病、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎等疾病。以上研究对象均来自无血缘关系的浙江汉族人群，所有入选者均签署知情同意书，本研究获得温州医科大学附属第二医院医学伦理学委员会批准。

2.RT-qPCR检测结肠组织中DcR1、DcR2和OPG的表达水平：(1) 标本采集：56例UC患者和62例性别、年龄相匹配的良性结肠息肉患者均采用结肠镜活检钳留取乙状结肠部位 (距肛缘30cm) 的黏膜组织，大小约2mm×2mm×2块，一部分置于-80℃冻存备用，另一部分用4%多聚甲醛固定保存，石蜡包埋后以4～5μm厚度连续病理切片。(2) RT-qPCR检测：采用TRIzol试剂 (美国Invitrogen公司)，按照试剂盒说明书，在严格无菌条件下提取结肠组织总RNA。NanoDrop-2000分光光度计(美国Thermo公司)检测RNA纯度和浓度。使用反转录试剂盒 (美国Applied Biosystems公司) 合成cDNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如下：β-actin上游引物：5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游引物：5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′；DcR1上游引物：5′-GTGGTTCGTTTTGATTTGCCC-3′，下游引物：5′-CGTGTTGATTGTGACTCGTGGA-3′；DcR2上游引物：5′-AACATGGTCCTGCTTGTGACG-3′，下游引物：5′-ATCTGCGGTCTCACTGGTCTG-3′；OPG上游引物：5′-CCTGGATTTGGAGTGGTGCAA-3′，下游引物：5′-AATGCCTCCTCACACAGGGTA-3′；以cDNA为模板，严格按照RT-qPCR试剂盒(美国Applied Biosystems公司)说明书进行实验操作，25μl反应体系中含cDNA 2.5μl，上下游引物各1.0μl，2×real time RT-PCR Mix 12.5μl和适量去离子水。反应程序：95℃预变性10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。采用2-△△CT法计算mRNA相对表达量。

3.免疫组织化学法检测结肠组织中DcR1、DcR2和OPG蛋白表达水平：主要试剂包括鼠抗人DcR1、DcR2、OPG抗体 (英国Abcam公司)，抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒 (丹麦Dako Denmark A/S公司)。石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，然后二甲苯脱蜡，经梯度乙醇水化，切片PBS浸泡后，用PBS冲洗3次，每次5min。切片置于pH 6.0柠檬酸缓冲液中微波修复，微波炉中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。自然冷却后用PBS洗3次，每次5min。切片放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS洗3次，每次5min，甩干后用5%牛血清白蛋白 (BSA) (瑞士罗氏公司) 室温20min封闭非特异性反应位点。每张切片加入50μl 200倍稀释的鼠抗人DcR1、DcR2、OPG抗体 (英国Abcam公司) 覆盖组织，4℃过夜。PBS洗3次，每次5min。去除PBS液，每张切片加50～100μl的抗兔/鼠通用型免疫组化二抗 (丹麦Dako Denmark A/S公司)，4℃孵育50min。PBS洗3次，每次5min。去除PBS，每张切片加50～100μl新鲜配制二氨基联苯胺 (DAB) 溶液，显微镜下控制显色时间。显色完全后，蒸馏水冲洗，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化 (1s)，蒸馏水冲洗，1%氨水(NH3·H2O) 返蓝，自来水冲洗。最后切片经过梯度乙醇(70%～90%～95%～100%)各10min，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。免疫组化结果判定以细胞质或细胞核中出现棕黄色为阳性。在200倍镜下每张切片随机选取5个视野，用Image-Pro Plus 6.0软件 (美国Media Cybernetics公司) 分析每张图片中阳性染色部分的平均光密度 (IOD/Area) 值，取均值表示DcR1、DcR2、OPG蛋白表达水平。

结 果

1.DcR1、DcR2、OPG基因多态性与UC易感性的关系:UC组和对照组中，DcR1 (rs12549481)、DcR2 (rs1133782)和OPG (rs3102735) 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(UC组：P=0.543，0.763，0.845；对照组：P=0.666，0.587，0.582)。非条件Logistic回归分析发现，与对照组比较，UC组中DcR2 (rs1133782)的突变等位基因(A)和基因型(GA+AA)频率均显著增高(15.18% vs 6.45%，OR=2.595，95%CI：1.073～6.274，P=0.030；28.57% vs 12.90%，OR=2.700，95%CI：1.053～6.926，P=0.035，表1)。而其他两个SNP的突变等位基因和基因型频率在UC组和对照组之间比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.UC组和对照组的结肠组织中DcR1、DcR2、OPG mRNA表达水平比较:UC患者结肠组织中DcR2 mRNA表达水平显著低于对照组(4.49±2.29 vs 9.49±4.06，t=8.134，P<0.01)。56例UC患者中，携带DcR2(rs1133782)(GG)基因型40例，(GA)基因型15例，(AA)基因型1例。与携带DcR2(rs1133782)基因型 (GG) 的UC患者比较，携带DcR2 (rs1133782)(GA+AA)基因型的患者结肠组织中DcR2 mRNA表达水平显著降低(3.64±1.63 vs 6.62±2.35，t=5.43，P<0.01)。而UC组中，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735)不同基因型携带者之间DcR1、OPG mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3.UC组和对照组的结肠组织中DcR1、DcR2、OPG蛋白表达水平比较：UC组结肠组织中DcR2蛋白表达水平显著低于对照组(0.180±0.052 vs 0.273±0.069，t=8.322，P<0.01，图1)。UC患者中，与携带DcR2 (rs1133782)(GG)基因型的患者比较，携带DcR2 (rs1133782)(GA+AA)基因型的患者结肠组织中DcR2蛋白表达水平也显著降低(0.129±0.028 vs 0.198±0.047，t=7.147，P<0.01，图2)。而UC组中，DcR1和OPG的不同基因型携带者之间蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。

表1 溃疡性结肠炎(UC)组和对照组DcR1、DcR2、OPG基因多态性分布差异[n(%)]

图1 两组结肠组织中DcR2蛋白的染色结果(HE,×400)A.对照组;B.UC患者

图2 UC患者结肠组织中DcR2蛋白的染色结果(HE,×400)A.基因型GG;B.基因型GA+AA

讨 论

人类DcR1、DcR2基因均定位于8号染色体短臂2区1～2带。DcR1 (rs12549481)位于启动子上游第376个碱基位点，当该位点野生型等位基因(T)突变为(C)后可能在转录水平影响DcR1蛋白表达水平[11,12]。DcR2 (rs1133782)位于第7外显子，此SNP的等位基因(G)突变为(A)时，可以使正常的亮氨酸突变为丝氨酸，从而导致DcR2蛋白质空间构象和生理功能发生异常[13]。OPG基因位于染色体8号染色体长臂2区4带，OPG (rs3102735)位于启动子上游第759个碱基位点，此等位基因(C)突变为(T)时可能影响OPG的蛋白质表达水平[14]。理论上，TRAIL凋亡信号主要受TRAIL及其受体的影响。

笔者前期研究发现，DcR2 (rs1133782)基因多态性可能影响UC的易感性，OPG (rs3102735)基因突变不仅会增加UC的患病风险，还可能影响UC的疾病严重程度。本研究也证实DcR2(rs1133782)突变可能增加UC的发病风险，但因为样本量所限，故未进行进一步分层分析。近年来，DcR1、DcR2和OPG基因多态性及其表达水平与多种肿瘤及自身免疫性疾病的相关性研究备受研究者的关注。Riccioni等[11]发现急性髓性白血病中DcR1、DcR2的表达水平增高，并与该病病程显著相关。有研究报道，DcR1 (rs12549481)基因多态性与韩国人群早期非小细胞肺癌的发病无显著相关性[15]。另有研究显示，DcR1 (rs12549481)基因多态性与中国汉族人群 T细胞淋巴瘤发病风险亦无显著关联[16]。Ulybina等[17]研究报道，DcR2 (rs1133782)基因多态性与俄罗斯人群肺癌的发病风险无明显关联。还有研究显示DcR2 (rs1133782)基因多态性与中国汉族人群的T细胞淋巴瘤的发病风险无显著相关性[16]。此外，有研究者对法国前列癌患者的研究显示DcR2水平下调能提高前列腺癌中LNCaP细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感度，提示DcR2可能与前列腺癌的发病有关[12]。

Büneker等[13]研究认为DR4/(DcR1+DcR2)之比可作为预测肿瘤细胞是否对TRAIL诱导的凋亡反应敏感的指标。Liu等[14]研究发现DcR2是p53的靶基因之一，受内源性p53结合位点的调控，并且DcR2还能调节患者对化疗药物的敏感度。另有研究报道DcR1、DcR2对死亡受体的影响存在差异，DcR2优先抑制DR5诱导的凋亡反应，提示在诱骗受体中，DcR2可能较DcR1的作用更为重要[18]。Christoph等[19]研究发现，OPG mRNA表达水平与前列腺癌患者癌细胞扩散相关。另有研究发现CD8+T细胞表面DcR1和DcR2的表达水平与RA的严重程度相关。Ney等[20]在高加索人群中发现携带OPG (rs3102735)等位基因(C)发生乳腺癌的风险性将增加1.5倍。对自身免疫性甲亢的研究显示，OPG (rs3102735)基因多态性与患者的骨密度相关，该位点等位基因(C)的携带者，其远端胫骨发生骨密度降低的风险性可能增加。Assmann等[21]研究报道OPG(rs3102735)基因多态性与德国人群RA的易感性无关。另有研究显示,OPG(rs3102735)基因多态性可能不影响银屑病的易感性。

本研究采用RT-qPCR和免疫组化法检测结肠组织中DcR1、DcR2、OPG mRNA和蛋白水平，结果发现与良性结肠息肉对照组比较，UC患者结肠组织中DcR2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低。本研究还在携带不同基因型的UC患者之间，进一步分析比较结肠组织中DcR1、DcR2、OPG mRNA和蛋白表达水平是否存在差异。结果发现与携带DcR2(rs1133782) (GG)基因型的UC患者比较，携带(GA+AA)基因型的UC患者结肠组织中DcR2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低，但对照组和UC患者之间以及携带不同基因型的UC患者之间DcR1、OPG mRNA及蛋白表达水平比较差异均无统计学意义。上述研究结果提示，DcR2 (rs1133782)基因突变可能降低UC的发病风险，机制可能通过降低DcR2 mRNA和蛋白表达水平发挥作用，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735) 基因多态性及其肠组织表达水平与UC的发病风险无显著关联。而DcR1和DcR2抑制TRAIL凋亡机制的差异充分表明TRAIL凋亡信号的调节机制及影响因素相当复杂。综合上述研究结果，笔者推测在UC病程中DcR2对TRAIL凋亡信号的抑制作用可能比DcR1更为重要，DcR2 (rs1133782)可能是影响UC易感性的潜在功能性位点，突变后可能造成DcR2蛋白的空间结构和功能发生异常，使DcR2对TRAIL凋亡信号的抑制效应降低，进而影响UC的发病风险。OPG属分泌型糖蛋白，是一种可溶性游离受体，在体内主要发挥抑制破骨细胞发生和增加骨密度的作用。在正常生理状态下，与TRAIL的其他受体比较，OPG与TRAIL的亲和力最弱，所诱导的凋亡抑制作用也显著弱于DcR1和DcR2[22]。

综上所述，本研究发现DcR2 (rs1133782)基因突变可能降低UC的发病风险，机制可能通过降低DcR2 mRNA和蛋白表达水平发挥作用，DcR1 (rs12549481)和OPG (rs3102735) 基因多态性及其结肠组织表达水平与UC的发病风险无显著关联。但由于TRAIL诱导凋亡的机制纷繁复杂，本研究尚无法阐明DcR2 (rs1133782)影响UC发病的具体机制，有待于后续研究进一步探讨和论证。