脑缺血后不同时间段血管内皮生长因子表达和微血管形成的关系

李成建

（郑州大学附属郑州中心医院ICU 河南郑州450007）

缺血脑卒中是我国乃至世界范围内较为普遍的致死性疾病，大部分脑卒中患者均存在不同程度、不同方面的功能障碍。近年来，有关血管内皮生长因子（VEGF）在缺血性脑卒中治疗中的作用已得到广泛研究，但大多数研究通过大鼠脑组织切片获得微血管密度数据，缺乏连续观察，对于微血管密度与VEGF 之间的时间效度关系没有十分明确的数据说明[1～2]。随着激光散斑成像（LSI）、激光扫描共聚焦（LSC）技术的出现，研究者可以更加容易获取不同时间点大脑中动脉血供情况，同时还可以通过抽取脑脊液检测VEGF 浓度[3]。本研究通过Longa 线栓法建立左大脑中动脉缺血MCAO 模型，观察微血管密度与脑脊液VEGF 浓度之间的关系。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物模型制备、 检测方法与观察指标 选取40 只成年雄性SD 大鼠（上海市斯莱克动物实验有限责任公司提供），标准环境饲养，Longa 线栓法建立左大脑中动脉缺血MCAO 模型。分别于术后1 h、3 d、7 d、28 d 分4 次，每次10 只，采用LSI 技术检测血流，LSC 技术检测微血管密度，酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠脑脊液VEGF 浓度。

1.2 统计学分析 数据采用SPSS22.0 统计学软件分析。计量资料用（）表示，计数资料用%表示，采用方差分析、多元线性回归相关性分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠大脑中动脉血供、 微血管密度、 脑脊液VEGF 浓度随时间变化情况 重复测量方差分析显示，Longa 线栓法术后大鼠大脑中动脉血供缺血后3 d 比缺血后1 h 增加（F=12.422 3，P＜0.01），缺血后7 d 比缺血后3 d 增加（F=8.470 3，P＜0.01），缺血后28 d 比缺血后7 d 增加（F=10.195 5，P＜0.01）；微血管密度缺血后3 d 比缺血后1 h 增加（F=2.434 2，P=0.012 2），缺血后7 d 比缺血后3 d 增加（F=3.466 4，P=0.0023），缺血后28d 比缺血后7 d 增加（F=1.122 5，P=0.040 1）；脑脊液VEGF 浓度缺血后3 d 比缺血后1 h 增加（F=30.110 7，P＜0.01），缺血后7 d 比缺血后3 d 降低（F=3.288 9，P=0.001 8），缺血后28 d 比缺血后7 d 降低（F=4.120 0，P=0.037 1）。见表1。大鼠大脑中动脉血供及微血管密度随时间增加而持续增加，而脑脊液VEGF 浓度在第3 天达到高峰后即开始下降。见图1。

表1 大鼠大脑中动脉血供、微血管密度、脑脊液VEGF 浓度变化情况

表1 大鼠大脑中动脉血供、微血管密度、脑脊液VEGF 浓度变化情况

指标 缺血后1 h 缺血后3 d 缺血后7 d 缺血后28 d中动脉供血（%）微血管密度（%）脑脊液VEGF浓度（pg/ml）38.53±2.41 1.17±0.63 0.65±0.15 62.84±3.32 2.10±0.70 4.56±0.34 77.09±3.98 5.56±0.62 4.09±0.89 92.01±3.02 5.98±1.21 2.10±0.52

图1 大鼠大脑中动脉血供、微血管密度、脑脊液VEGF 浓度随时间变化情况

2.2 大鼠缺血后微血管密度与VEGF 浓度的相关性分析 多元线性回归分析显示，微血管密度=0.023+1.724×时间-0.096×VEGF 浓度，提示大鼠缺血后微血管密度与术后时间、VEGF 浓度存在线性关系（F=524.681，P=0.000）。见图2。

图2 大鼠缺血后微血管密度与VEGF 浓度的相关性

3 讨论

动物实验[3]证实，VEGF 对缺血性疾病有明显的治疗意义，但外源性VEGF 难以透过血脑屏障，且进入循环系统后半衰期过短，实际治疗价值十分有限。在动物实验中，直接将外源性VEGF 输入大鼠脑室，可以明确观察到缺血区血管内皮细胞增殖形成血管[4]。虽然VEGF 增加毛细血管通透性作用是组胺的5 万倍，有致脑组织肿胀、脑疝形成等风险，但是VEGF 同时对神经前体细胞的增殖具有明显调控作用，与神经发生有关，具备神经营养与神经保护作用[5]。因此，在严格控制VEGF 剂量效应关系的情况下，可以最大发挥VEGF 减小脑梗死体积的作用而减少脑水肿效应。

既往研究[6]显示，脑组织缺血后VEGF 家族不同时间表达情况有所差异，但都能直接促进血管内皮细胞快速增殖并新生血管形成。也有研究[7～8]发现，在脑组织缺血48 h 后即出现血管内皮细胞增殖微血管发生，且VEGF 表达也会在缺血后1 d 开始。但是这些研究获取的VEGF 表达情况以及大鼠微血管密度数据均是来自于不同个体，设计存在缺陷。本研究采用LSI 采集大鼠大脑中动脉血流数据，LSC 技术采集微血管形成数据，未处死大鼠，可以连续观察大鼠脑缺血阻断后血供以及微血管形成情况。在Longa 线栓法术人工干预造成大鼠脑缺血后1 h、3 d、7 d 和28 d，分别测得大脑中动脉血供、微血管密度以及脑脊液VEGF 浓度。虽然本实验过程中有4 只大鼠发生死亡，但是得到一组同一个体不同时间点连续观察的实验数据。重复测量资料的方差分析显示，大鼠脑缺血后1 h、3 d、7 d、28 d 这4 个时间点大脑中动脉血供、微血管密度、脑脊液VEGF浓度比较差异均有统计学意义。脑脊液中VEGF 浓度高峰出现在缺血后1 h 到缺血后7 d 之间，缺血后3 d 测得浓度为（4.56±0.34）pg/ml，由于实验设计时未防止过于频繁暴露大鼠皮下伤口，选择时间上偏重于1 h、3 d、7 d、28 d，脑脊液VEGF 浓度峰值更为准确的出现时间暂不得而知，需要下一步实验缩短检测时间差。但是在本研究中，微血管密度是持续升高的，期间没有微血管密度高峰表现，与既往研究[9]结果基本一致。回归分析亦表明大鼠缺血后微血管密度与术后时间、VEGF 浓度存在线性关系（F=524.681，P=0.000）。由于将术后时间作为有序变量赋值纳入方程，得到的微血管密度与VEGF 负相关结果与一般认识有所出入，需要下一步实验进一步优化观察。

综上所述，脑组织缺血后VEGF 表达与微血管密度之间存在明显相关性，VEGF 存在一个表达高峰，大概在缺血后1 h～7 d，位于缺血后3 d 左右，而微血管发生是一个持续发展过程。但是本研究实验方法有一定局限性，在进行大鼠颅骨打磨时由于每只大鼠颅骨厚度差异，并不能保证大鼠颅骨厚度能够完全一致，LSI、LSC 成像时会有一定偏差。而且每只大鼠测量数据之后没有处死，而是进行伤口闭合，期间伤口情况可能对实验数据造成一定影响。