小果卫矛愈伤组织诱导及植株再生体系的建立

袁云香

(1.西北工业大学生命学院，西北工业大学特殊环境生物物理学研究所，空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室，西安 710072； 2.渭南师范学院环境与生命科学学院，渭南 714099)

小果卫矛(Euonymusmicrocarpus(Oliv.) Spraggue)为卫矛科(Celastraceae)卫矛属(Euonymus)常绿灌木，为我国独有树种，仅分布于少数几个地方如陕西、山西、湖北、四川等地，近年在北京地区引种成功。小果卫矛其叶片革质，椭圆形、阔倒卵形或卵形，对生；其花黄绿色，花期为5～6月，聚伞花序、花瓣近圆形、花盘方圆；蒴果近长圆状，4浅裂，裂片向外平展，果期10～11月；种子棕红色，长圆状，长约5毫米，外被橘黄色假种皮，极具观赏价值。此外，小果卫矛还具有药用价值，其根、茎具有祛风湿，强筋骨之功效，可用于风湿痹痛，筋骨痿软[1～3]。

由于自然地理位置及气候条件的原因，我国北方地区常绿树种主要是针叶类的松柏科植物、女贞及大叶黄杨等少数的阔叶植物，缺少常绿、耐寒阔叶乔木和灌木树种。王永格等研究发现小果卫矛抗寒性高于大叶黄杨、胶东卫矛和女贞[4]，因此小果卫矛是极具开发潜力的、适宜北方地区引种栽培的常绿观赏植物。关于小果卫矛的研究大部分集中在分布、生态习性、生物活性等方面，何云研究了小果卫矛的内生真菌[5]；张双进等对小果卫矛扦插生根进行了研究，发现其扦插生根较难[6]；王永格等研究了小果卫矛的抗寒性，发现小果卫矛抗寒力大于女贞和大叶黄杨[4]；秦浩等调查发现小果卫矛目前为山西天然分布卫矛属植物中的唯一常绿植物[7]。而对小果卫矛的繁殖技术的研究主要以种子繁殖和常规扦插、嫁接为主，但由于小果卫矛种子繁殖效率低，常规的扦插繁殖较难生根，致使其规模繁殖受限，因此限制了小果卫矛的开发与利用。组织培养具有不受生长季节限制、繁殖快等优点，可在短时间内获得大量无性系。目前，关于卫矛属其他植物的组织培养已有报道，袁云香等[8]建立了陕西卫矛高效再生体系；樊祥义等[9]对金叶桃叶卫矛进行了初步组织培养；赵丽蒙等[10]对卫矛进行了不定芽诱导。而关于小果卫矛组织培养尚未见报道。本试验以小果卫矛嫩茎为外植体，研究不同浓度植物生长调节剂对小果卫矛愈伤组织诱导、增殖、再分化及生根的影响，建立小果卫矛再生体系，以期为小果卫矛的快速繁殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料小果卫矛(E.microcarpus(Oliv.) Spraggue)采自陕西杨凌西北农林科技大学校内，剪取当年生颜色淡绿、无病虫害嫩茎为外植体，带回实验室备用。

1.2 方法

1.2.1 外植体灭菌

将小果卫矛嫩茎放置于烧杯内，用软毛刷蘸洗洁精轻轻将茎表面脏物洗净，于流水下冲洗1～2 h后，转自超净工作台内进行外植体消毒处理。采用75%酒精和0.1%升汞溶液配比，75%酒精处理时间分别设为10、20和30 s，0.1%升汞溶液设置为10、15和20 min。设置9种消毒组合进行浸泡处理。消毒完后用无菌水冲洗5～7次，将茎段表面的水分用无菌滤纸吸干，在培养皿中将嫩茎剪成2.0～3.0 cm长的小段作为外植体，接种于诱导培养基上。接种2周后统计污染率，每个三角瓶接种外植体4块，15瓶共60个外植体，每组处理重复3次。

1.2.2 小果卫矛愈伤组织的诱导

小果卫矛愈伤组织诱导试验按照正交设计L9(34)，采用3个因素分别是3种基本培养基(MS、WPM和B5)、6-BA(1、2、3 mg·L-1)和2,4-D(1、2、3 mg·L-1)，每个因素3水平，共9个处理组合。于接种40 d后统计诱导率，并记录愈伤组织的生长状态。

1.2.3 小果卫矛愈伤组织的再分化

切取质地较致密、颜色淡黄的胚性愈伤组织，接种到含有不同浓度6-BA和NAA的MS分化培养基上，每个分化处理接种15瓶，每瓶接种4块愈伤组织。每个试验处理重复3次。密切观察并记录愈伤组织的再分化状态，于35 d后统计再分化率。

1.2.4 小果卫矛生根培养

当小苗生长至2～4 cm时，分离单株转至生根培养基上进行生根培养。1/2MS培养基中含有不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0和2.5 mg·L-1)的NAA。于35 d后统计生根数及生根率，密切观察生根情况并做好记录。每个处理接种10瓶，每组试验重复3次。

上述培养基中均添加蔗糖30 g·L-1、琼脂8 g·L-1、pH为5.8～6.0。组培材料置于光照强度25～35 μmol·m-2·s-1，光照时间14 h·d-1，培养温度(25±2)℃的光照培养箱中培养。

1.2.5 数据处理及分析

污染率(%)=污染的外植体数/接种的外植体总数×100%

(1)

存活率(%)=存活的外植体数/接种的外植总体数×100%

(2)

愈伤组织诱导率(%)=出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100%

(3)

再分化率(%)=再生出苗的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数×100%

(4)

生根率(%)=生根苗数/接种苗数×100%

(5)

运用SPSS 22.0统计分析软件进行显著性分析和Duncan多重对比。

2 试验结果

2.1 不同灭菌处理对小果卫矛外植体染菌率的影响

外植体灭菌效果是直接影响组织培养成败的重要因素，不同的消毒方法、消毒剂和消毒时间对外植体的污染率和存活率的影响差异较大。单独使用一种消毒剂，污染率较高。因此，试验采用75%酒精和0.1% HgCl2联合处理小果卫矛茎段，不同灭菌时间组合对外植体的影响不同(见表1)。污染率随着灭菌处理时间的延长而降低，但存活率却呈现出先上升后下降的趋势。75%酒精处理30 s和0.1% HgCl2处理20 min(编号10号)，污染率最低，为0.933%，存活率仅为81.33%，但茎段表面有一定程度的褐化，尤其是切口端脱水明显。75%酒精处理30 s和0.1% HgCl2处理15 min，存活率最高，为92.33%，茎段受损程度较轻。HgCl2处理时间越长，对外植体的损失越大。综合分析试验结果，75%酒精处理30 s和0.1% HgCl2处理15 min，存活率最高，污染率相对较低，因此，对于小果卫矛茎段来说，最佳的灭菌处理组合为75%酒精30 s，0.1% HgCl215 min(编号9号)。

表1 不同灭菌组合对外植体污染率的影响

Table 1 Effect of different sterilization combinations on contamination rates of explants

编号No.75%酒精75% of alcohol(s)0.1% HgCl2(min)污染率Pollution rate(%)存活率Survival rate(%)1101094.33±2.33g0.33±0.33a2101574.67±1.76f20.00±0.58b3102071.33±0.88f21.67±1.20b4201063.00±2.08e32.33±1.45c5201552.33±0.88d46.33±1.20d6202035.00±1.73c59.33±2.33e7301014.00±2.31b83.67±0.88f830152.00±0.58a92.33±1.20g930200.933±0.18a81.33±1.45f

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05) 下同

Note:The different lowercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.05 The same as below

2.2 不同因素对小果卫矛愈伤组织诱导的影响

小果卫矛茎段接种到诱导培养基上，培养7 d左右，茎段基部接近培养基的切口处表现为肥大，颜色变淡，21 d左右切口处有膨大的愈伤组织现象，颜色淡白色，40 d后愈伤组织体积增大，颜色变为淡黄色、小颗粒状(见图1:A～B)。不同植物生长调节物质组合对小果卫矛愈伤组织的发生和生长状态影响不同。正交实验设计的培养基中小果卫矛愈伤组织诱导率统计结果见表2。

表2 不同因素对小果卫矛愈伤组织诱导的影响

Table 2 Effects of different actors on callus induction ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

编号No.A培养基MediumB6-BA(mg·L-1)C2,4-D(mg·L-1)诱导率Induction rate(%)1MS11.041.90±0.68a2MS22.055.30±2.06b3MS33.079.00±0.58d4WPM12.039.00±1.73a5WPM23.051.50±1.04be6WPM31.075.50±2.12cd7B513.037.60±1.37a8B521.052.30±0.95bd9B532.073.20±1.74c

表3 愈伤组织诱导培养的方差分析

方差分析发现(见表3)，小果卫矛愈伤组织诱导率在3个因素间差异明显，6-BA和不同培养基对小果卫矛愈伤组织诱导率的影响达到极显著水平(P<0.01)；2,4-D对小果卫矛愈伤组织诱导率的影响差异不显著(P>0.05)。

多重比较发现(见表4)，基本培养基不同类型对小果卫矛愈伤组织诱导影响最大的是水平1(MS培养基)，与水平2(WPM培养基)和3(B5培养基)呈极显著差异(P<0.01)，其均值高于其他两个水平；6-BA的3个水平间在小果卫矛愈伤组织诱导率上的影响均具有显著差异(P<0.05)，6-BA水平3(3.0 mg·L-1)、水平2(2.0 mg·L-1)与水平1(1.0 mg·L-1)差异极显著(P<0.01)，说明6-BA不同浓度对小果卫矛愈伤组织诱导影响很大。2,4-D各水平间影响差异不显著，但具有协同作用，因此其浓度选择最低的水平为适宜。综上，通过分析平均值可得出，小果卫矛愈伤组织诱导最佳培养基组合为A1B3C1，即MS+3.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-12,4-D。

表4 不同因素对小果卫矛愈伤组织诱导影响的多重比较

Table 4 Multiple comparisons of effects of different actors on callus induction ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

FactorsLevelsMean0.05 level0.01 level培养基Medium158.73aA255.33bB354.37bB6-BA375.9aA253.05bAB139.5cB

注：同列不同小写字母表示差异显著(0.05水平)；不同大写字母表示差异极显著(0.01水平)

Note: The different lowercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.05;The different uppercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.01

表5 不同植物生长调节物质对小果卫矛愈伤组织再分化率的影响

Table 5 Effects of different plant growth regulators on the regeneration rate ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

编号No.6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)再分化率Regeneration rate(%)10.00.0021.00.012.50±0.29c31.50.041.10±0.59d42.00.041.67±0.26d52.50.045.27±1.78e60.00.23.80±1.53b71.00.212.73±0.43c81.50.241.83±0.09d92.00.278.83±0.43i102.50.252.57±0.30g110.00.54.13±0.88b121.00.512.93±0.18c131.50.541.37±0.20d142.00.564.93±0.52h152.50.549.73±0.37f

2.3 不同6-BA和NAA配比对小果卫矛愈伤组织再分化的影响

将生长良好、颗粒状愈伤组织切成小块，接种到不同的分化培养基上。小果卫矛愈伤组织转入分化培养基7 d左右，愈伤组织颜色由淡黄色逐渐转为淡黄绿，体积也增大(见图1:C～D)；在培养14 d左右时，愈伤组织颗粒状突起更明显，颜色变为深绿色，体积增大明显；部分愈伤组织出现肉眼可见的小绿芽点(见图1:E)。随着培养时间的延长，绿芽点数量也逐渐增多，芽点进一步分化为芽丛，35 d左右愈伤组织分化出再生植株(见图1:F～G)。

不同种类及不同浓度组合的植物生长调节物质是影响植物再分化的重要因素。试验设计不同浓度6-BA和NAA组合对小果卫矛愈伤组织的再分化影响不同。由表5可知，当分化培养基中未添加任何植物生长调节物质时，未见有愈伤组织分化。在只附加NAA浓度为0.2 mg·L-1时，愈伤组织出现分化，但分化率较低，仅为3.80%，只添加1.0 mg·L-16-BA时，愈伤组织分化率为12.50%；随着NAA和6-BA浓度的升高，愈伤组织分化率也分别随之升高。

在同时添加6-BA与NAA的组合中，在相同浓度NAA水平下，再分化率随6-BA浓度的递增而呈抛物线状变化，6-BA浓度在1.0～2.0 mg·L-1范围内，分化率逐渐升高；以浓度2.0 mg·L-16-BA时分化率最高，为78.83%，当6-BA浓度提高到2.5 mg·L-1时，分化率则略有下降，由此可见细胞分裂素与生长素配比使用更有利于再分化。综合试验结果可知，适宜小果卫矛茎段愈伤组织再分化的培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，分化率最高，达到78.83%，不定芽生长态势较好。

2.4 不同浓度NAA对小果卫矛生根的影响

将小果卫矛分化出的小苗与愈伤组织分离出来，接种到含有不同浓度NAA的生根培养基中，在第15天时部分小苗基部开始膨大，20 d左右开始出现白色不定根，培养35 d时小苗根长至3 cm左右，根系较粗，小苗生势良好(见图1:H)。

表6 不同浓度NAA对小果卫矛生根的影响

Table 5 Effects of different NAA on differentiation of rooting stems ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

编号No.NAA(mg·L-1)生根率Rooting rate(%)10020.236.33±0.20b30.438.00±0.57b40.647.00±1.15d50.866.00±1.00e6183.23±0.62g71.275.27±0.37f81.575.63±0.32f9264.17±0.44e102.542.00±1.15c

图1 小果卫矛茎段愈伤组织的诱导及植株再生 A.外植体接种；B.培养40 d后的形成愈伤组织；C.分化培养7 d的淡黄绿愈伤组织；D.分化培养14 d的绿色愈伤组织；E.分化培养21 d的小绿芽；F～G.分化培养35 d的再生植株；H.生根培养35 d的不定根Fig.1 Callus induction and shoot regeneration from stems of E.microcarpus(Oliv.) Spraggue A.Explants inoculated; B.Callus inducted culture for 40 d; C.Light yellowish green callus differentiation culture after 7 d; D.Green callus of differentiation culture after 14 d; E.Green sprouts after 21 d differentiation culture; F-G.Regenerated plantlets after 35 d differentiation culture; H.Rooting of plantlets for 35 d

由表6可知，在未添加NAA的培养基中，未见小苗生根现象，仅表现为小苗茎段延长及叶片增大。当NAA的浓度范围为0.2～1.0 mg·L-1时，生根率呈上升趋势，NAA 1.0 mg·L-1时，生根率最高，为83.23%；而NAA浓度在1.2～2.5 mg·L-1范围内时，生根率有逐渐下降趋势，且根系较细弱，主侧根不明，植株矮小，长势差。因此，最佳小果卫矛愈伤组织再生植株生根培养基为1/2 MS+NAA 1.2 mg·L-1，生根率为83.23%，生长状态好，主根明显，植株生长快且健壮，移栽成活率高。

3 讨论

外植体消毒是小果卫矛再生体系建立的重要环节，选择不同消毒剂的种类、采取不同的消毒时间显得尤为重要。张丽杰等[11]在研究桃叶卫矛的组织培养时发现，7%酒精浸泡30 s后再用0.1%升汞浸泡10 min消毒效果好。周魏等[12]在双歧卫矛的组织培养中发现茎段最佳消毒方法为70%酒精15 s，0.1%升汞8 min。本试验采用75%酒精消毒30 s后再用0.1%升汞消毒12 min，二者联合使用效果最好，污染率为2%。

在愈伤组织诱导过程中，不同基本培养基、植物生长调节物质的不同浓度与不同种类的配比，愈伤组织诱导率也不同。基本培养基是植物组织培养的重要基质，植物的遗传背景不同及生物学特性各异，对各类营养成分的需求也有差异。本试验选用了3种(MS、WPM和B5)基本培养基，附加不同浓度的6-BA和2,4-D，采用正交设计试验，发现小果卫矛适宜愈伤组织诱导的基本培养基为MS，可能是由于MS培养基中钾盐、铵盐、硝酸盐等无机盐浓度较WPM和B5高，更适宜小果卫矛茎段诱导愈伤组织，这与赵丽蒙等研究卫矛组织培养的结果较一致[10]。小果卫矛愈伤组织诱导率主要受到6-BA浓度的影响，在一定范围内，诱导率随6-BA浓度的升高而升高，且诱导出的愈伤组织在之后的再分化过程中更容易再分化出芽点，这与余慧等[13]研究欧洲卫矛组织培养的研究结果相似。

植物所需植物生长调节物质的种类和浓度，在不同培养阶段是不同的，二者以适宜浓度配比使用有利于再生植株的生长发育，浓度过高或过低，都会影响再生植株发生及长势。在本研究中发现，小果卫矛愈伤组织再分化过程中联合使用细胞分裂素和生长素比单独用一种更有利于愈伤组织分化。较高浓度的6-BA与适宜浓度NAA有助于小果卫矛愈伤组织再分化，而NAA浓度过高对再分化不利。本试验建立了小果卫矛愈伤组织植株再生体系，这为解决小果卫矛野生资源匮乏打下基础，对种质资源的开发与利用等后续的研究具有重要意义。