古籍书库空气真菌种属调查

任珊珊

（国家图书馆，北京 100081）

空气微生物广泛存在于环境中，主要包括细菌、真菌、病毒等生命体，其中已发现的真菌有4万余种，主要粒径分布在3～100μm[1]。它们的存在不仅威胁人类健康，更会对古籍、档案和文物等造成不可逆转的损坏。近年来，针对空气中真菌的研究已经成为图书馆、档案和文博行业的基础研究内容之一。故宫博物院采用平皿沉降法在各个库房采样，其中书画组存放的东西司库等8个库房主要有枝孢霉，黄曲霉等霉菌[2]。三峡博物馆文物库房中空气真菌主要种属为曲霉属（70%）和青霉属（13%）[3]。放线菌、枝孢属、青霉属和链格孢属等大量存在于魏晋五号壁画墓的墓室空气中，成为威胁砖壁画保存的重要污染源[4]。中国农业大学图书馆空气中霉菌主要为青霉属和曲霉属[5]。

1 材料与方法

1.1 实验设备与试剂

北京明杰蓝天FA-1六级筛孔式空气微生物采样器，德国MEMMERT IPP200培养箱，上海博迅YXQ-LS-100G立式压力蒸汽灭菌器，苏州净化SW-CJ-2FD双人超净台，太仓强乐THZ-C型空气恒温振荡器，德国SIGMA 3-30k离心机，日本Nikon 90i显微镜，美国Bio-Rad MyCylerPCR仪，北京六一DYY-6C电泳仪电源，上海精科WFH-201B紫外透射反射仪和四川优普UPT-30L纯水机等。

琼脂糖、琼脂、葡萄糖、Tris-硼酸和无水乙醇等（国药试剂）；上样缓冲液、DNA ladder和GoldView核酸染色剂（Solarbio）；乳酸酚棉蓝染色剂（青岛海博）；Taq聚合酶（Apexbio）；通用型基因组提取试剂盒、为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪）等。

1.2 样品采集方法

2019年4月在国家图书馆古籍书库进行采样。书库配备有恒温恒湿空调机组，用于控制书库内的温度和相对湿度。采样期间，书库温度为24℃，相对湿度为48%。采用撞击式采样法，参数设置为采样速度28.3L/min，采样2.5min。采样时使用PDA培养基。培养基倒置放入生物培养箱。培养条件为28℃±1℃，培养 7d。

1.3 形态学分析方法

平板点植接种培养，每皿三点。新接种的培养基倒置于生物培养箱中，28℃±1℃，培养7d。培养结束后记录菌落形态。取小块真菌培养物置于载玻片，乳酸酚棉蓝染色法染色后置于显微镜下观察真菌菌丝和孢子的形态特征。

1.4 分子鉴定方法

提取样品总DNA。使用通用型基因组DNA提取试剂盒，根据操作说明提取筛选出的真菌基因组DNA。提取后的DNA于-80℃保存备用。

目标片段扩增（PCR）。使用真菌ITS PCR通用引物。ITS1:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’；ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。配置PCR 反应体系。2XTaq-pcr MIX：25μL；ITS1(10μM)：2μL；ITS4(10μM)：2μL； 基因组 DNA：2μL；ddH2O：19μL， 总计50μL。反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸 1min；设定仪器后开始PCR扩增试验，循环35次；72℃延伸10min。获得PCR产物。

目标片段的确定与回收。取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳试验，待DNA Marker各条带跑开显示清晰后，结束电泳。紫外灯下观察凝胶中的DNA条带，并切出含有目标DNA的凝胶。根据回收试剂盒提供的方法进行DNA回收。

基因测序及序列分析。将回收产物送至北京睿博兴科公司进行测序。利用BLAST方式将测序所得序列在GenBank数据库中进行比对，获得和测序DNA序列同源性最高的真菌ITS序列，确认样品的种属信息。

2 结果与分析

采集得到的样品根据形态特征可归类为5种真菌，分别编号为 F-01、F-02、F-03、F-04 和 F-05。对它们进行纯化培养，观察其菌落及菌体形态，并进行后续的分子鉴定工作。

2.1 优势真菌的形态学观察

将选出的5种真菌进行点种纯化培养7d后，观察其真菌菌落形态，可发现不同真菌产生的色素各不相同，菌落质地也有很大区别，具体特征见表1。

表1 真菌菌落形态特征

用乳酸酚棉蓝染色法挑菌制片，镜检观察真菌菌体形态，放大倍数均为400×，结果如图1所示。可以看出：F-01菌丝分隔，分生孢子梗较短，分生孢子呈棒状；F-02菌丝不分隔，分生孢子梗较长。分生孢子球形或椭圆形；F-03菌丝分隔，孢子呈卵圆形；F-04细胞个体为圆形或卵圆形，有明显的压制现象；F-05分生孢子头近球形，小梗双层，放射状排列，顶端有链形孢子。

图1 真菌显微形态特征

2.2 优势真菌的分子鉴定

提取5种优势真菌的基因组DNA，利用真菌ITS PCR扩增通用引物对基因组DNA进行PCR扩增，得到目标基因，即真菌ITS基因。琼脂糖凝胶电泳确认后回收DNA，结果如图2所示。将获得的产物测序后，得到其序列信息。在GenBank中比对得到同源性最高的DNA片段的GenBank登录号，确定优势真菌的种属信息，见表2。得到结果：古籍书库空气中的优势真菌有链格孢属的极细链格孢霉，拟青霉属的拟青霉SL95，枝孢霉属的枝孢样枝孢霉，隐球酵母属的大隐球酵母和曲霉属的杂色曲霉。

图2 优势真菌ITS基因凝胶电泳

表2 菌种鉴定信息

3 讨论

在古籍书库中进行空气真菌采样，筛选出5种优势真菌，结合形态学和分子鉴定结果，发现这五种真菌分别为链格孢属的极细链格孢霉，拟青霉属的拟青霉SL95，枝孢霉属的枝孢样枝孢霉，隐球酵母属的大隐球酵母和曲霉属的杂色曲霉。这与2013年所作调查北京市居家环境空气中主要真菌种类青霉属、枝孢属、曲霉属、链格孢属和茎点霉属接近[6]。本次研究明确了古籍书库中优势空气真菌种类，可为书库的日常有害生物预防和真菌爆发性增长时的治理提供必要的技术支持。