微滴数字PCR与ARMS法检测非小细胞肺癌EGFR和EML4-ALK基因的结果比较

李秀忠，郭雅琪，董 辉，董 洁，赵倩颖，赵志军

肺癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中80%～85%为非小细胞肺癌(NSCLC)。2015年全国肿瘤防治研究办公室对2012年恶性肿瘤登记资料进行分析的数据显示，全国恶性肿瘤发病第1位及肿瘤死亡首位均为肺癌，每年新发病例约70.5万，死亡病例约56.9万[1]。面对如此严峻的形势，医学界一直致力于寻找肺癌的最佳诊疗方案。近年来，靶向治疗已经开始在肿瘤治疗中占有重要地位，尤其是针对NSCLC不同驱动基因的靶向药物的不断研发上市以及其令人鼓舞的治疗效果，更加促进了驱动基因检测的需求。目前可用于驱动基因检测的前沿技术中，突变扩增阻滞系统(ARMS)法是国内应用最为广泛和成熟的方法，而微滴数字PCR(ddPCR)技术以其高灵敏度的特点和可绝对定量的优势已经开始崭露头角。本研究旨在通过比较ddPCR法和ARMS法联合检测NSCLC两种主要驱动基因——表皮生长因子受体(EGFR)基因和棘皮动物微管相关类蛋白4/间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因的结果，探讨ddPCR技术在NSCLC驱动基因检测方面的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2015年1月-2018年6月期间宁夏医科大学总医院初诊的73例NSCLC患者的石蜡包埋标本(手术切除组织标本21例，活检小标本34例，胸水细胞蜡块标本18例)。其中男性占58.90%(43/73)，女性占41.10%(30/73)；年龄29～78岁，中位年龄59岁；吸烟者占41.10%(30/73)，非吸烟者占58.90%(43/73)；Ⅰ～ⅢA期患者占34.25%(25/73)，ⅢB～Ⅳ期患者占65.75%(48/73)；腺癌占90.41%(66/73)，鳞癌占6.85%(5/73)，腺鳞癌占2.74%(2/73)。

1.2 纳入标准：入组患者均为有明确病理诊断的肺腺癌患者，所有病理切片均由两位高年资病理医师重新独立阅片复诊。病理诊断标准参照WHO(2015)肺肿瘤组织学分类[2]。临床分期采用国际抗癌联盟(UICC)第八版的TNM分期标准[3]。入选患者采集标本前未接受过化疗、放疗或靶向治疗，并排除肺外有其他组织来源的实体肿瘤或血液肿瘤的情况。本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会审查和批准。

1.3 石蜡组织DNA和RNA的提取：使用厦门艾德公司FFPE样品DNA/RNA共分离试剂盒(离心柱型)提取石蜡标本的DNA和RNA。严格按照说明书进行实验操作，得到的DNA和RNA保存于-80 ℃，两周内进行检测。检测前将核酸室温溶解混匀，使用美国Denovix超微量紫外可见分光光度计(DS-11)对核酸的浓度和纯度进行检测。调整DNA的上机浓度为1.5～3 ng/μl，并且OD260/OD280在1.8～2.0之间；RNA的上机总量在0.1～5 μg，并且OD260/OD280在1.9～2.1之间。

1.4 ARMS法检测EGFR和EML4-ALK基因：使用厦门艾德公司人类EGFR基因突变检测试剂盒和人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒进行检测。严格按照试剂盒说明书进行实验操作，使用美国ABI 7300荧光定量PCR仪进行检测。

1.5 ddPCR法检测EGFR和EML4-ALK基因：检测试剂盒均由上海源奇生物医药科技公司提供。仪器采用美国伯乐公司QX200微滴式数字PCR系统，通用试剂耗材均为伯乐公司原装进口。

1.6 统计学方法：采用IBM SPSS 20.0统计软件，两种检验方法的一致性比较采用Kappa系数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ddPCR法与ARMS法检测EGFR基因结果一致性比较：在73例NSCLC标本中，ARMS法检测EGFR基因的总突变率为43.84%(32/73)，ddPCR法的总突变率为49.32%(36/73)，两种检测方法具有高度一致性(K值=0.890，P<0.05)；21例手术切除组织标本中，ARMS法的突变率为47.62%(10/21)，ddPCR法的突变率为52.38%(11/21)，两种方法具有高度一致性(K值=0.905，P<0.05)；34例活检小标本中，ARMS法的突变率为44.12%(15/34)，ddPCR法的突变率为47.06%(16/34)，两种方法具有高度一致性(K值=0.941，P<0.05)；18例胸水细胞蜡块标本中，ARMS法的突变率为38.89%(7/18)，ddPCR法的突变率为50.00%(9/18)，两种方法具有高度一致性(K值=0.778，P<0.05)，见表1。

表1 在不同类型标本中ddPCR法与ARMS法检测EGFR基因结果一致性比较

2.2 ddPCR法与ARMS法检测EML4-ALK融合基因结果一致性比较：在73例NSCLC标本中，ARMS法和ddPCR法检测EML4-ALK融合基因的总突变率均为5.48%(4/73)，两种检测方法结果完全一致。

2.3 ddPCR法与ARMS法检测EGFR和EML4-ALK基因的具体突变情况：ARMS法检测73例NSCLC患者EGFR基因中，Exon 18-G719X、Exon 19-del、Exon 20-T790M和Exon 21-L858R的突变率分别为1.37%(1/73)、21.92%(16/73)、1.37%(1/73)和19.18%(14/73)；ddPCR法检测EGFR基因中，Exon 18-G719X、Exon 19-del、Exon 20-T790M和Exon 21-L858R的突变率分别为4.11%(3/73)、20.55%(15/73)、4.11%(3/73)和17.81%(13/73)。有6例标本两种检测方法的结果不相符，其中2例标本ARMS法检测为阴性，ddPCR法检测为Exon 18-G719X位点阳性(突变丰度分别为0.20%和0.50%)；2例标本ARMS法检测为阴性，ddPCR法检测为Exon 20-T790M位点阳性(突变丰度分别为0.10%和0.20%)；1例标本ARMS法检测为Exon 19-del阳性，ddPCR法检测为19-del+T790M双重突变阳性(突变丰度为19-del 5.00%/T790M 0.15%)；1例标本ARMS法检测为Exon 21-L858R阳性，ddPCR法检测为L858R +T790M双重突变阳性(突变丰度为L858R 9.50%/T790M 0.17%)。EML4-ALK融合基因在两种检测方法中的结果完全一致，突变率为5.48%(4/73)。两种方法均未检出EGFR和EML4-ALK基因的共存突变，见表2。

表2 ddPCR法与ARMS法检测EGFR和EML4-ALK基因的具体突变情况

3 讨论

肺癌是世界范围内死亡率居首位的恶性肿瘤，国家癌症中心2015年发布的数据显示，2006年-2011年我国肺癌5年患病率是130.2%(1/10万)。其中男性84.6%(1/10万)，居恶性肿瘤第2位；女性45.6%(1/10万)，居恶性肿瘤第4位[4]。面对严峻的形势，医学界针对肺癌的治疗手段在不断进步和更新。随着分子诊断技术的飞速发展和小分子靶向药物的不断研发上市，NSCLC驱动基因的检测和靶向治疗已经成为肺癌精准医疗的两个重要组成部分。ARMS法是国内检测NSCLC驱动基因EGFR和EML4-ALK应用最早、最广泛和最成熟的方法。ddPCR是近几年新兴的技术，因为它具有高灵敏度和可实现对结果的绝对定量的特点，已经开始在分子诊断检测领域备受青睐。在常宁[5]的研究中，使用ddPCR法对血液与组织标本EGFR基因检测的一致性为90.91%，检测方法的敏感度、特异度分别为70.83%、100%。袁世洋等[6]的研究纳入国内外10项诊断性研究，Meta分析的结果显示ddPCR对血液EGFR基因各个突变位点的检测平均灵敏度在0.67～0.71之间，平均特异性在0.79～0.99之间，表明ddPCR法具有较高的灵敏度和特异性。其他几项研究[7-8]也具有相似的结论。本研究中，ARMS法检测EGFR基因的总突变率为43.84%，ddPCR法的总突变率为49.32%，结果具有高度一致性；分别统计不同标本类型中两种检测方法的结果同样具有高度一致性。但可以观察到，ddPCR法检出的突变例数均略高于ARMS法，表明ARMS法存在漏检的情况。而在EML4-ALK融合基因检测方面，两种方法的结果完全一致。ARMS法出现漏检情况的原因在于其方法学灵敏度的局限性。ARMS法的方法学灵敏度可达到检测出10 ng野生型DNA背景中含量低至1%的EGFR基因突变，以及EML4-ALK融合基因含量低至25拷贝的质粒DNA。而ddPCR技术的灵敏度可达到0.1%。黄斐等[9]使用自建数字PCR平台检测EGFR基因T790M突变，其灵敏度为0.01%，且在0.01%～100%范围内具有良好的线性。在对NSCLC治疗的过程中，肿瘤组织对靶向药物的耐药性是几乎不可避免的[10]，其中一半以上的耐药突变为T790M位点。Wenxian Wang等[11]使用ddPCR法和ARMS法检测75例患者的血浆样本，T790M突变率分别为46.7%(35/75)和25.3%(19/75)。曹紫阳等[12]研究表明ddPCR法在靶向治疗耐药后NSCLC患者的血浆T790M突变检测方面有很高的灵敏度，在指导临床NSCLC靶向药物治疗方面具有良好的前景。Watanabe[13]的研究中，使用数字PCR技术检测到治疗前EGFR敏感突变肺癌患者的T790M阳性率为79.9%，突变丰度在0.009%～26.9%之间，其中94.6%的突变丰度<0.05。在李锐等[14]的研究中，同样应用ddPCR法和ARMS法对不同类型肺癌标本进行配对检测，出现5例结果不一致的标本为胸水细胞蜡块和血浆标本，ARMS法未检出的突变位点包括T790M和L858R，其突变丰度均在1%以下。本研究中，6例标本的ARMS法结果阴性，与配对的ddPCR法结果不一致。其中4例为ARMS法的T790M位点未检出，2例为G719X位点未检出，而这些位点经ddPCR检测后证实，其突变丰度均<1%。但在EGFR基因和EML4-ALK融合基因的总体检测能力方面，两种方法具有高度一致性。这说明ddPCR技术在NSCLC驱动基因检测方面具有非常好的应用价值，特别是对于突变丰度极低的位点比ARMS法具有更好的检测能力。

另外，多种驱动基因联合检测的方案已经被越来越多的临床诊疗指南所推荐，也在多项新近研究[15-16]中被采用。联合检测解决了临床实践中经常遇到的肿瘤组织标本量少、无法多次提供切片的问题，还避免了进行多次基因检测的漫长等待，为患者争取到宝贵的治疗时机。本研究选择了NSCLC中最主要的两个驱动基因EGFR和EML4-ALK进行联合检测，主要针对吉非替尼和克唑替尼两类NSCLC的靶向药物，对于宁夏等经济相对欠发达地区的患者而言是比较经济和高效的检测方案。