反应挤出与酶法联合制备多孔淀粉工艺的优化

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(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

多孔淀粉是一种新型改性淀粉,与天然淀粉相比具有多孔海绵状结构和较大比表面积。因为这一结构特性,多孔淀粉具备许多优于天然淀粉的性能,如良好的吸附性能[1]。多孔淀粉作为淀粉的高附加值产品,可作为风味物质载体、止血剂、重金属离子吸附剂、脂肪替代物等,具有独特的优势[2-4],在食品、农业、医药、农业和化妆品等领域得到了广泛的应用[5-6]。

常见的多孔淀粉制备法有物理、化学和生物法[7-8]。其中,生物法是指通过酶作用淀粉的无定形区,在淀粉颗粒上形成连接淀粉中心的孔洞的方法,被认为是一种简便、安全、工业化的方法[9]。生物法制备多孔淀粉常用的酶有α-淀粉酶和糖化酶,它们的协同作用能够有效提高多孔淀粉的制备效率。然而,天然淀粉由于其颗粒特性,如低比表面积和高比例的结晶区域,通常酶水解缓慢且效果不佳[10]。为了提高复合酶与淀粉的反应效率,常采用前处理辅助天然淀粉的酶解。目前湿热法、超声波等前处理方法已被广泛研究[11]。

反应挤出是一种特殊的挤出加工技术,指在挤压过程中各种物料于挤出机内,在螺杆转动下实现的物理、化学、生物反应的过程。在挤压过程中引入酶可在挤压过程中加强酶对底物的作用。先前的研究表明,引入酶的反应挤出技术可以产生多孔结构[12-13]。反应挤出可以增加淀粉的糊化度,使淀粉颗粒表面粗糙,增加淀粉对酶的敏感度,进而提高酶解效率[14]。然而,关于挤压预处理反应挤出联合酶作用制备多孔淀粉的文献资料较少。因此,研究反应挤出与酶联合对多孔淀粉制备的影响很有必要。

因此,本文采用反应挤出作为前处理,联合复合酶水解制备多孔淀粉,采用Placket-Burman Design(PBD)实验、最陡爬坡实验和Box-Benhnken Design(BBD)试验优化反应挤出复合酶法联合制备多孔淀粉工艺,使用扫描电镜观察四种不同类型的淀粉样品,为优化多孔淀粉制备工艺及多孔淀粉质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米淀粉 诸城兴贸玉米开发有限公司;糖化酶(酶活81916 U/g，最适温度60 ℃,最适pH4.0～4.5)、中温α-淀粉酶(酶活2879 U/g，最适温度50～70 ℃,最适pH5.5～7.5) 北京奥博星生物技术有限责任公司;大豆油 嘉里粮油(中国)有限公司;柠檬酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸等试剂 均为分析纯。

FMHE36-24型双螺杆挤压机 螺杆直径36 mm,长径比24∶1，湖南富马科食品工程技术有限公司;AL104型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;EMS-30型恒温水浴搅拌器 上海百典仪器设备有限公司;TDL-5A型离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海柏欣仪器设备厂;SU-1510扫描电子显微镜 日本日立株式会社;SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式真空泵 长沙明杰仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 反应挤出淀粉挤出物的制备 将玉米淀粉与中温α-淀粉酶按照一定比例均匀混合30 min,置入喂料斗,挤压过程中通过调节双螺杆挤压机的温度、螺杆转速、喂水量收集挤出物。挤出物经冷冻干燥后,粉碎待用。

1.2.2 多孔淀粉的制备 实验利用酶法制备多孔淀粉[1]。向250 mL锥形瓶中加入一定量的挤出物(或普通玉米淀粉——作为对照组)与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液,混合均匀后加入糖化酶,在一定的温度、pH、底物浓度、酶解时间下制备多孔淀粉。通过向体系中加入1 mL、4 mol/L的NaOH终止反应,15 min后加入1 mL、4 mol/L HCl平衡pH。将酶解液离心(4500 r/min,5 min),舍弃上清液并洗涤沉淀3次。将沉淀放入40 ℃烘箱中干燥24 h后研磨过100目筛,即得多孔淀粉。

1.2.3 Plackett-Burman试验 根据前期单因素预实验,设计实验次数N=12的Plackett-Burman试验[15],选取挤压温度(X1)、物料水分含量(X2)、螺杆转速(X3)、α-淀粉酶添加量(X4)、酶解时间(X5)、糖化酶添加量(X6)、pH(X7)、酶解温度(X8)、底物浓度(X9)为Plackett-Burman试验设计因素。每个因素选取低、高两个水平,高水平约为低水平的1.5倍。试验因素与水平表见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素与水平表Table 1 Variables and assigned concentrations of Plackett-Burman test

1.2.4 最陡爬坡试验 将由Plackett-Burman试验确定的影响实验结果的显著因素,根据系数估计值确定爬坡方向,将正系数因素的值按照一定步长逐步增加,负系数因素的值逐步减小,按照一定步长设计最陡爬坡试验,寻求最佳响应区域。

1.2.5 Box-Behnken响应面试验 在最陡爬坡试验确定的最大响应值区域内,以多孔淀粉吸油率为响应值,以多孔淀粉制备中的主要因素物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解时间、糖化酶添加量为因素,设计Box-Behnken试验。

表2 Box-Behnken响应面试验因素与水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface test

1.3 指标测定

1.3.1 吸油率的测定 多孔淀粉对油的吸附属于无选择性吸附,可以通过吸油率来表征多孔淀粉的成孔情况[16-17]。将2 g淀粉样品称入50 mL烧杯中,与大豆油在室温下不断搅拌30 min。吸附后的大豆油和淀粉经布氏漏斗抽滤5 min保证分离完全。吸附速率计算公式如下:

式中:m为样品重量,g;m1为滤纸重量,g;m2为滤纸和过滤后样品总重量,g。

1.3.2 扫描电镜分析 干燥后的淀粉样品用导电胶带均匀地分布在样品台上,镀金后在扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)内加压观察其微观结构[18],放大倍数为2500倍。

1.4 数据处理

实验采用Design-Expert 8.0进行方法设计,试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman筛选试验

表3 Plackett-Burman试验设计结果Table 3 Experimental design and result of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman设计实验结果方差分析及显著性检验Table 4 Results of regression analysis of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡试验

最陡爬坡设计及结果如表5所示。随着物料水分含量的减小,α-淀粉酶添加量、酶解时间及糖化酶添加量的增加,多孔淀粉的吸油率呈现出先增大后减小的趋势。说明实验号3比较接近最佳响应区域。因此,以物料水分含量36%、α-淀粉酶添加量0.5%、酶解时间8 h、糖化酶添加量1.7%为试验中心点设计Box-Behnken响应面优化试验。

表5 最陡爬坡实验结果Table 5 Results of the steepest ascent design

2.3 Box-Behnken响应面优化试验

2.3.1 Box-Behnken 试验设计 通过Box-Behnken试验设计对物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解时间、糖化酶添加量4个因素进行分析,得到Box-Behnken响应面试验设计及结果见表6,回归方程显著性检验及方差分析见表7。经多元回归分析,建立各因素与吸油率(Y)之间的二次回归方程:Y=68.55+0.22A+0.53B-0.86C+0.65D-1.24AB+0.38AC-1.63AD-0.28BC+0.05BD-0.67CD-2.16A2-1.71B2-2.02C2-1.76D2

表6 Box-Behnken响应面试验设计及结果Table 6 Experiment design and results of response surface methodology from Box-Behnken design

表7 回归方程显著性检验及方差分析Table 7 Significance test and variance analysis of regression equation

2.3.2 Box-Behnken响应面曲面交互作用分析 图1为影响吸油率的各个因素之间的响应面曲面交互作用图。通过判断等高线的圆形程度和响应面的坡度,判断各个因素之间的交互作用。响应面坡度越陡峭,等高线越密集,说明响应值对该条件的改变越敏感,该因素对吸油率的影响越大[20-21]。AB、AD之间存在极显著交互作用,且响应值最优点均在试验考察的区域范围内。

图1 物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解时间、糖化酶添加量对多孔淀粉吸油率影响的响应面Fig.1 Response surface of the effects of water supply,α-amylase addition,enzymolysis time and glucoamylase addition on the oil absorption of porous starch

2.3.3 验证试验 通过对响应面图的分析可以得出,吸油率Y存在最大值。利用Design-Expert可得对应因素物料水分含量取35.7%,α-淀粉酶添加量取0.52%,酶解时间7.7 h,糖化酶添加量取1.73%。此时吸油率达到最大值68.83%。考虑到实验条件的可操作性,将最优条件修正为:物料水分含量取36%,α-淀粉酶添加量取0.52%,酶解时间7.7 h,糖化酶添加量取1.73%。为了验证模型的准确性,在修正条件下进行验证,取三次重复试验平均值,所得吸油率为68.49%,与预测值基本相符(相对误差为0.58%),说明通过Design-Expert确定最大值是可靠的[21]。而采用复合酶水解得到的对照多孔淀粉的吸油率59.57%,试验组的多孔淀粉吸油率提高了14.97%。

2.4 多孔淀粉微观结构分析

图2为不同方式处理得到的淀粉样品的扫描电镜图片。天然玉米淀粉为一种表面光滑的球形和椭圆形颗粒,其粒径在5～26 μm之间[22]。经过酶解处理后的多孔淀粉颗粒(图2b)表面有较大孔洞,然而,这些孔洞分布数量较少且不均匀。经过反应挤出处理的淀粉(图2c)表面形成小的、数量较多的孔,这些孔增大了淀粉的比表面积,且可成为酶易攻击的位点[23-25]。图2d为反应挤出联合复合酶水解形成的多孔淀粉,可以看到孔的分布较均匀,孔数量增大,比表面积增加,导致吸油率升高。

图2 多孔淀粉的扫描电镜图(2500×)Fig.2 Scanning electron micrography of native starch(2500×)注:a为普通玉米淀粉;b为由普通玉米淀粉水解制备的对照多孔淀粉;c为反应挤出玉米淀粉;d为反应挤出联合酶水解法得到的多孔淀粉。

3 结论

本研究以玉米淀粉为原料,多孔淀粉吸油率为指标,利用Placket-Burman Design试验、最陡爬坡试验和Box-Benhnken Design试验对反应挤出联合复合酶法制备多孔淀粉工艺进行优化,最佳工艺参数为:物料水分含量36%、α-淀粉酶添加量0.52%、酶解时间7.7h、糖化酶添加量1.73%,挤压温度70 ℃、螺杆转速120 r/min、pH5.0、酶解温度50 ℃、底物浓度25%,此条件下制备的多孔淀粉吸油率达到最大值68.49%,较对照组提高了14.97%。反应挤出与酶l h作用方法有效提高了多孔淀粉的制备效率,产品在孔的数量、孔径大小、分布均一性等方面,都较天然淀粉酶解法制备方法有了明显的提升,且制备过程不涉及有机试剂,是一种对环境友好的多孔淀粉制备新方法。该研究为高效制备高品质多孔淀粉提供了一种新的途径,可进一步为反应挤出与酶联合制备多孔淀粉的工业化生产提供依据,可广泛作为吸附剂和封装剂应用于各种食品中。另外,反应挤出联合复合酶法制备得到的多孔淀粉,其吸附解析等理化特性以及不同应用场合的具体问题还有待进一步研究。