长江中游鳙群体的微卫星遗传多样性分析

沙 航，罗相忠，邹桂伟，梁宏伟

(中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

鳙(Aristichthysnobilis)俗称花鲢，是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一。2018年全国养殖产量达309.64万吨，仅次于草鱼和鲢[1]。随着水利设施的兴建，洄游通道和产卵场被破坏，鳙的自然群体遭受到了极大冲击，种群群体数量急剧下降，成为长江主要鱼类中数量减少最显著的种类之一[2]。与此同时，人工养殖个体逃逸以及遗传资源管理的不科学也对自然群体遗传多样性造成一定的扰动[3,4]。为了恢复长江水生生物多样性和渔业资源，近年来开展了大规模的增殖放流，鳙等四大家鱼亲本放流工作也取得了良好的效果[5]。科研工作者先后利用同工酶、RAPD、线粒体DNA和微卫星等技术对长江鳙群体的遗传多样性进行了分析，长江中下游鳙具有丰富的遗传多样性[6]，人工繁殖群体的遗传多样性明显低于自然群体[7]，而放流群体与天然群体的遗传多样性相差不大[8]。长江中游江段及其一级支流是鳙重要的自然产卵场，是维持长江中游鳙种质资源的重要场所，持续长期监测长江中游鳙自然群体的遗传结构和遗传多样性，对评估长江中游鳙种质资源现状以及制定科学的增殖放流渔业管理措施具有重要意义。本研究采用微卫星分子标记对长江水系中游的3个鳙群体的遗传本底进行分析，以期为今后保护和合理利用种质资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本来源与基因组DNA提取

3个鳙群体于2018年5月分别采自石首老河国家四大家鱼原种场(石首，SS)，监利老江河国家四大家鱼原种场(监利，JL)和湖南鱼类原种场(长沙，CS)，石首和监利原种场采集的鳙样本均为繁殖季节在长江采集的幼苗经原种场培育而成的1龄鳙，湖南鱼类原种场的鳙采自湘江。每个群体随机采集30尾个体，共90尾。鳍条经无水乙醇固定后置于-20 ℃保存。取0.2 g鳍条组织经无菌水漂洗后置于2 mL离心管烘干剪碎，用高盐法提取基因组DNA[9]，经1%琼脂糖电泳检测后，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 微卫星引物及PCR扩增检测

采用本课题组自行开发的12对微卫星引物，并用Fam荧光基团修饰上游引物的5′端(表1)，引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，包含2×Taq PCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，50 ng/μL模板DNA 1 μL，dd H2O 9.5 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 15 s，53～57 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物在ABI Prism3730 XI 测序仪进行毛细管电泳，采用DataCollection 软件和GeneMarker V2.2.0软件采集和分析数据并输出等位基因扫描图谱，然后分析各个位点的基因型。

表1 鳙12对微卫星引物信息Tab.1 Primers information of 12 microsatellite markers of A.nobilis

1.3 数据处理

用Popgene32软件分析各个微卫星位点在3个鳙群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity)、期望杂合度(He)、Shannon信息指数(I)，并计算群体间的Nei′s遗传距离。Hardy-Weinberg平衡偏离指数(D)按以下公式计算：D=(Ho-He)/He。基于群体间的Nei′s遗传距离用MEGA X软件绘制NJ聚类图。用Arlequin3.1软件计算两两群体间的遗传分化指数(Fst)，采用分子方差分析(AMOVA)计算群体的遗传结构，通过1 000次模拟重复抽样检测群体间Fst值的显著性[10]。用Cervus3.2软件计算各位点的多态信息含量(PIC)。

2 结果分析

2.1 微卫星位点的多态性

12对微卫星引物在SS、JL和CS 3个群体中共检测到117个等位基因，3个群体中Na介于5～19，Ne为1.731～11.567，平均Na和Ne分别为9.750和4.050(见表2)。其中Ans055和Ans196位点Na最多(19个)，Ans014和Ans119位点Na最少(5个)。12个位点Ho为0.398～0.778，He为0.425～0.919，其中11个位点偏离Hardy-Weinberg平衡(D<0)。I为0.782～2.588。PIC为0.371～0.907，平均PIC为0.618。12个位点中有8个位点为高度多态位点(PIC>0.5)，4个位点为中度多态位点(0.25

表2 鳙12个微卫星位点的遗传多态性Tab.2 Genetic diversity of 12 microsatellite loci in A.nobilis

2.2 鳙3个群体的遗传多样性

石首、监利和长沙 3个鳙群体遗传多样性见表3。3个群体平均Na介于5.500～8.500，平均Ne为3.294～4.244，平均Ho和平均He分别介于0.557～0.582和0.620～0.730，其中长沙群体的平均Ne、平均He和I均最高。从PIC上看，长沙群体的遗传多样性最高，而石首群体的遗传多样性相对较低，整体上3个群体的PIC较高(PIC>0.5)，遗传多样性较丰富。

表3 鳙3个群体的遗传多样性Tab.3 Genetic diversity among the three populations of A.nobilis

2.3 鳙3个群体间的遗传分化

3个鳙群体间的Nei′s遗传距离和遗传分化指数见表4。3个群体间的遗传距离为0.031 9～0.076 6，监利与长沙群体遗传距离最大(0.076 6)，石首和监利群体间的遗传距离最小(0.031 9)。群体间遗传分化指数为0.002 5～0.023 7，其中石首、监利和长沙3个群体两两之间的遗传分化指数均小于0.05，三个群体之间遗传分化程度较低。基于群体间Nei′s遗传距离的NJ聚类结果如图1所示，石首和监利群体先聚为一支，然后与长沙群体聚为一支。AMOVA分析显示(表5)3个群体中群体内的遗传变异占总体变异的95.60%，群体间的遗传变异为4.40%，3个群体间遗传分化指数为0.044(Fst<0.05)，表明群体间的遗传变异主要来自群体内的个体之间。

表4 鳙3个群体间的遗传距离(对角线下)和遗传分化指数(对角线上)Tab.4 The genetic distance (below diagonal) and genetic differentiation indices (above diagonal) among the three populations of A.nobilis

图1 基于遗传距离构建的3个鳙群体的NJ聚类树Fig.1 NJ clustering tree of tht three populations of A.nobilisbased on Nei′s genetic distance

表5 鳙3个群体的AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis among the three populations of A.nobilis

3 讨论

3.1 鳙群体的遗传多样性

群体的遗传多样性和遗传潜力可以用等位基因数、杂合度和多态信息含量等遗传参数来衡量[11]。杂合度是反映群体遗传变异程度的重要参数，杂合度越大遗传多样性越高[12]。本研究中的SS(He=0.633)、JL(He=0.651)和CS(0.730)3个群体的杂合度均高于朱晓东[13](石首， He=0.287 6；监利，He=0.321 4)和田华[14](监利，He=0.550 2)的研究结果，与朱传坤[15]的研究结果较为接近(石首老河，He=0.661)。长沙群体的多态信息含量(0.606)高于单淇[16]的研究结果(0.557)，而杂合度略低。基于Botstein[17]的群体遗传多样性判别标准，本研究的3个群体的遗传多样性均较高(PIC>0.5)。目前长江中游3个群体的遗传多样性仍保持在较高水平。遗传多样性与群体的大小呈一定的正相关。鳙的自然群体中以长江群体数量最大，基因库最丰富[18]。虽然其经历高强度捕捞、产卵场破坏、栖息环境恶化等，但近十年来随着国家和地方对渔业资源的保护，鳙的增殖放流活动持续开展，其遗传多样性并未发生持续性下降。

本研究中石首、监利和长沙3个群体大多数位点表现为杂合子缺失(D<0)。耿波等[19]在对鳙的四川和江西群体研究中也发现存在杂合子缺失现象。关于杂合子缺失的形成原因目前仍存在争议，可能与研究群体样本量、种群退化、性别比例失衡和无效等位基因有关[20,21]，就本研究而言可能是由于分析的样本数量较少或位点上存在无效等位基因导致。傅洪拓等[22]对长江不同江段日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)的研究中发现，日本沼虾82.5%的群体位点表现为杂合子缺失，推断其主要是无效等位基因导致的。在青石斑鱼(Epinephelusawoara)[23]、大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)[24]和拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)[25]等微卫星分析中也存在由无效等位基因导致的杂合子缺失现象。

3.2 鳙3个群体的遗传结构

遗传距离是衡量群体间遗传分化的重要指标，群体间遗传距离越小，遗传分化程度越低，群体间亲缘关系越近[26]。固定指数(Fst)通常被用来衡量群体间的遗传分化程度，Fst<0.05时，群体间遗传分化较小；0.050.25时，群体间则遗传分化显著[27]。石首、监利和长沙3个鳙群体之间的Fst均小于0.05，三个群体间的遗传分化较小，鳙群体遗传变异主要来自群体内，群体内的变异贡献率为95.60%，群体间的遗传变异仅占4.40%，长江干流群体与长沙群体虽然存在一定的遗传分化，但变异主要来自群体内，与长沙群体存在一定的基因交流。李思发等[28]认为长江中下游群体间存在遗传差异，但群体分布没有地域性。单淇[16]对瑞昌、长沙和宁河三个鳙群体进行了分析，认为湘江鳙和长江干流鳙群体产卵场可能不同，存在一定的生殖隔离，而廖小林等[29]在草鱼上却发现长江干流草鱼群体与湘江草鱼仅存在轻微分化，可以认为属于一个长江群体。湘江是长江一级支流，于濠河口注入东洞庭湖，然后沿东洞庭湖湘江洪道经岳阳至城陵矶注入长江[30]。尽管湘江和长江干流存在不同产卵场，但湘江洞庭湖与长江干流并没有明显的地理阻隔，群体间存在基因交流的可能性，此外，长江中游大规模的增殖放流活动在一定程度上也可能弱化了江河阻隔，目前已有研究开始对经济鱼类开展标记放流，通过标记回捕评价放流效果[31]，长期放流对野生群体遗传渐渗及累加效应也在评估之中。就目前而言，长江中游三个群体具有较高的遗传多样性，长江干流群体与长沙群体间的遗传分化较小，鳙放流群体的亲本应尽可能来自长江自然群体，放流亲本群体应来自放流江段，避免长江鳙遗传多样性的降低及地理群体界限的混淆带来的潜在生态风险。