生物絮团系统(BFT)中PHBV为碳源对斑点叉尾鮰生长、水质及硝化反应的影响

邵李娜，Abakari Godwin，罗国芝,2,3，谭洪新,2,3，杨逸遵

(1.上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；2.上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；3.上海海洋大学水产科学国际级实验教学示范中心，上海 201306)

斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)食性杂、生长快、抵抗力强，对水中悬浮颗粒物有较强的耐受性，可应用于生物絮团技术(biofloc technology,BFT)养殖[1,2]。BFT技术通过絮团中的微生物将残饵、粪便中的营养物质转化为生物质，避免水体中氨氮的积累进而实现养殖水质的原位控制术、并能利用絮团促进养殖动物生长[3]。硝化过程被证明是BFT系统中氨氮的主要转化途径之一，原理是氨氧化微生物( ammonia oxidizing archaea,AOA[4]；ammonia oxidizing bacteria,AOB[5])在氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)催化下将氨氧化成羟氨之后,在羟氨氧化还原酶(hydroxylamine oxidereductase,HAO)作用下被氧化为亚硝酸 ，最后亚硝酸氧化细菌( nitrite oxidizing bacteria,NOB)通过亚硝酸氧化还原酶(nitrite oxidereductase,NOR)将亚硝酸盐氧化为硝酸盐[6]，或是由全程氨氧化微生物主导的单步硝化作用[7-8]。其中，AMO、HAO和NOR则是硝化过程中重要生物酶，催化着硝化反应的进行，并对其起到一定的制约作用。

生物絮团系统需要添加碳源以维持异养细菌的生长，传统碳源如葡萄糖、糖蜜、甘油等降解迅速，需要频繁添加，易添加不足或过量。生物可降解塑料如3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物(poly 3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate,PHBV)、聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)等生物可降解聚合物可缓慢释放有机物[9,10]，被证明能够为BFT养殖过程提供稳定的有机碳源[9]。研究表明， BFT中添加PHB，可促进罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[11]、罗非鱼(Oreochromismossanbicus)[12]、南美白对虾(Litopenaeusvannamei)[13]等的生长，并提高其抗病力，Qiao等[14]也发现PHB在肠道微生物作用下，可提高养殖动物的免疫力和抗病力。在BFT系统中将生物可降解聚合物作为碳源对养殖动物确有裨益，但其对于硝化过程中硝化酶的影响却未见报道。本实验通过在生物絮团中添加PHBV，研究其对斑点叉尾鮰生长、水质、硝化反应速率及其过程中各硝化酶的含量与分布影响，旨在从硝化反应各阶段的酶的角度，揭示添加PHBV对斑点叉尾鮰生长、水质及硝化反应的影响，进一步阐明硝化酶与硝化反应的关系，为BFT中缓释碳源的添加以及硝化反应的优化提供理论依据与实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验斑点叉尾鮰苗购于广东粤强丰水产有限公司，鱼苗健康有活力，体重为(9.25±2.53)g,体长为(8.63±0.8)cm,暂养2周。饲料购于通威饲料有限公司，为膨化配合饲料，其营养成分为:粗蛋白≥32.0% ，粗纤维≤13.0%，粗脂肪≥4.0%，粗灰分≤15.0%，水分≤12.5%。PHBV颗粒购于东莞市凯茜利塑胶原料有限公司。

1.2 实验设计

本实验共6个养殖桶，有效水体300 L，期间以一台罗茨鼓风机(750 W)供给曝气，维持溶解氧>5 mg/L。实验分为两组，每组三个重复，第一组不添加PHBV，为对照组(CL组)，第二组挂袋PHBV 颗粒(300 g)，为实验组(PHBV组)。实验开始前，以福建高农有限公司出产的鳗鲡饲料(粗蛋白≥ 48%、粗灰分≤ 17%、粗脂肪≥ 4%、水分≤ 10%)为氮源，葡萄糖作为碳源，进行生物絮团的预培养，每2 d检测总氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、溶解有机碳，培养周期为42 d，使初始总固体悬浮物(total suspended solid,TSS)为200 mg/L。培养结束后，每个桶放入30尾斑点叉尾鮰鱼苗，养殖周期为29 d。每天投喂4次，投喂率为体重的5%。每4 d检测水质及絮团相关指标，养殖期间不换水，不排出絮体，仅补充取样和蒸发而损耗的水，并及时添加小苏打以稳定pH。

1.3 各项指标检测方法及公式

1.3.1 水质指标检测方法

1.3.2 生长指标计算公式

成活率(SR)=(N2/N1)×100%

(1)

增重率(WGR)=(W2-W1)/W1×100%

(2)

特定生长率(SGR)=(lnW2-lnW1)/t×100%

(3)

饵料系数(FCR)=F/(W2-W1)

(4)

式中，N1：实验开始鱼的数量；N2：实验结束时鱼的数量；W1：实验开始时鱼的体重(g)；W2：实验结束时鱼的体重(g)；t：养殖天数(d)；F：饲料投喂量(g)。

1.3.3 絮团采样及检测方法

全菌絮团采样时，每组于3个反应器各取50 mL，混合后经高温灭菌的0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤；固着菌絮团采样时需静置5～10 min，等絮团沉降完全后，将上清液弃置，仅过滤沉降后的絮团，将滤膜折叠放入灭菌离心管，置于-20 ℃冰箱存放待测。

全菌絮团及固着菌絮团的 AMO、HAO及NOR含量的测定均采用ELISA试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司)测定，游离菌的AMO、HAO及NOR含量为两者之差。

1.4 数据分析

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行ANOVA 单因素方差分析，两组间数据结合独立样本t检验进行均值差异性分析，酶含量数据结合Duncan 氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。

2 实验结果

2.1 生长及水质指标

表1 养殖期间斑点叉尾鮰生长指标Tab.1 Growth performance of I.punctatus during cultivation

图1 养殖过程中及的变化趋势Fig.1 Trend of during cultivation

2.2 连续监测中三态氮的变化

图2 养殖过程中TN、TP、DOC及DOC/TAN的变化趋势Fig.2 Trend of TN、TP、DOC and DOC/TAN during cultivation

图3 养殖过程中絮团指标TSS及FV的变化趋势Fig.3 Trend of floc index TSS and FV during cultivation

2.3 连续监测中硝化酶的变化

图4 降解10 mg/L NH4Cl三态氮的变化趋势Fig.4 Trend of three-state nitrogen while degradating 10 mg/L NH4Cl

图5 TAN最高最高(B1/B2)及最高(C)时刻BFT中固着及游离硝化菌中AMO、HAO、NOR的含量Fig.5 Content of AMO,HAO and NOR of fixed and free nitrifying bacteria in BFT at the time of TAN maximum maximum(B1/B2)and maximum(C)

从固着菌及游离菌来看，PHBV组固着菌中的AMO、HAO、NOR均显著多于CL组，AMO含量CL组的固着菌无显著差异，PHBV组则在B2时显著大于A、C；HAO含量CL组的固着菌在B1时刻显著小于其他两时刻，PHBV组则在A时显著大于其他两时刻；NOR含量CL组的固着菌在B1时显著大于A、C，而PHBV组均无显著差异。除CL组C时刻NOR含量外，两组固着在生物絮团上的硝化细菌均显著多于游离于水体的细菌。PHBV组游离菌中AMO、HAO及NOR的含量与PHBV组并无显著差异，并未因三者总含量较少而减少，反而提高了CL组整个水体中游离硝化菌的占比。

3 讨论

3.1 PHBV对斑点叉尾鮰生长及养殖水质的影响

本实验经过29 d的养殖周期，两组的成活率、增重率、特定增长率以及饲料系数均无显著差异，与Chen等[17]发现PCL作碳源可促进革胡子鲶鱼(Clariasgariepinus)生长的结果不符，可能是养殖周期短的原因。

3.2 PHBV对硝化反应三态氮变动的影响

3.3 PHBV对硝化反应硝化酶的影响

氨氧化阶段是硝化反应的第一阶段，因氨氧化微生物中的AMO只能氧化非离子氨(NH3)，使其成为硝化作用的限速阶段[27-29]。因此虽然本实验中PHBV组的AMO、HAO、NOR含量均显著大于CL组，但限制硝化反应速率的只有AMO含量，与HAO、NOR含量关系不大。有研究发现土壤中的硝化速率与AOB的含量成正比，而与 AOA之间的关系并不明显[30,31]，因本实验无法根据AMO含量判断AOA与AOB的具体数量，因此可能PHBV组AOA的比例较高，导致其AMO含量虽显著大于CL组，但其硝化速率也并未提高。表明硝化反应速率与酶含量并不成正比，即使有着相同酶含量，不同种类的细菌对于硝化反应的作用也不同，体现了水体微生物的多样性及复杂性。

水体中固着在絮团上的硝化酶含量要显著多于游离于水体的，表明硝化细菌更倾向于固着于载体工作，此结论与李秋芳等[32]发现RAS中硝化细菌是生物膜上的优势菌的结论相符。有趣的是，游离硝化菌的酶含量在各时刻却较为稳定，不会因总酶量的减少而按比例降低。

4 结论