异丙肾上腺素制作大鼠心力衰竭恶病质模型及心功能和营养指标的变化

秦瑞丽 董志强 张昕 樊勤梅 赵欣

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院 1心功能科，内蒙古 包头 014010；2药剂科)

慢性心力衰竭(心衰)后期与恶性肿瘤相似，常会伴有机体消耗，表现为厌食、消瘦、贫血等，与葡萄糖、蛋白质代谢异常和脂肪组织分解、肌肉萎缩等相关，随着肌肉、脂肪组织和骨组织减少到一定程度就会出现以体重减轻、机体构成改变为特征的心衰恶病质(CC)〔1〕。流行病学调查发现，CHF患者中有10%～16%合并有恶病质的发生，其中50%患者在18个月内死亡，CC是心衰患者死亡的一个独立危险因素〔2〕。然而，其发生机制目前尚未明确，临床上所能采取的应对措施也非常有限。异丙肾上腺素(ISO)是常用的制作扩张型心肌病大鼠模型的药物，其主要的药理作用是通过激动心肌细胞上的β1受体，引起心肌细胞的强烈收缩造成心肌细胞缺血、损伤和断裂〔3〕。本研究拟探索制作心衰恶病质特征大鼠模型的ISO剂量。

1 材料与方法

1.1DCM大鼠模型的建立 选用清洁级10～12周龄雄性SD大鼠100只，体重280～300 g，由内蒙古大学实验动物中心提供。按照内蒙古实验动物饲养管理标准执行，北京科澳协力饲料有限公司提供的饲料为标准柱状饲料。动物分笼饲养于有空气过滤系统的安静环境中，室温维持在20～25℃，大鼠正常进食与活动。ISO由大连美仑生物有限公司提供。适应性饲养1 w后，随机抽取90只腹股沟皮下注射不同剂量的ISO制作心衰模型，分别为低剂量组〔120 mg/(kg·d)〕、中等剂量组〔180 mg/(kg·d)〕及高剂量组〔250 mg/(kg·d)〕。其余10只大鼠注射等体积9 g/(L·d)生理盐水作为对照组。注射ISO的方法：用0.9%生理盐水溶解粉剂ISO，终浓度为20 mg/ml，按3个剂量级，隔日1次，共2次，为了避免皮肤坏死，第2次换作另一侧进行注射，所有大鼠用药后正常进食和活动，饲养4 w后根据体重变化及超声心动图结果将ISO组分为CC组(较对照组体重下降>6%)与心衰非恶病质组(其余大鼠)。

1.2一般情况观察 注射ISO后观察大鼠的皮毛颜色、进食、活动等，记录死亡情况。

1.3模型成功的评价方法 (1)超声心动图检查：注射药物后清洁环境下饲养大鼠4 w后行超声心动图检查，10%的水合氯醛腹腔注射进行麻醉，取仰卧并固定四肢和头部于干净木板上。剪除胸部体毛，用S4-2高频探头飞利浦HD11XE彩色超声诊断仪，在二维超声引导下，选取左室乳头肌短轴切面进行检查。测量指标包括左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS)，每只测5个心动周期，取平均值。(2)组织病理学检查：取大鼠心肌组织，用冰生理盐水冲洗2遍，快速置于固定液(即95%乙醇：40%甲醛原液=9∶1的混合固定液)中固定后常规石蜡包埋，行Masson染色，光镜下观察心肌细胞组织学形态变化。(3)体重变化:所有大鼠注射药物前及注射后4 w分别记录体重。

1.4生化营养指标检测 注射药物4 w后，大鼠禁食12 h，取腹主动脉血分离血清，全自动生化分析仪检测血清中总白蛋白、三酰甘油、胆固醇、血糖。

1.5标本的收集和处理 (1)采集血样：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，取仰卧位，固定四肢和头部于手术台上，腹部去毛，于手术部位用5%乙醇消毒，从剑突下腹正中线切口，分层打开腹腔。在肾动脉分支以下钝性游离腹主动脉，连接采血管，采血量>5 ml，所采血于常温下保存30 min后，4℃，3 000 r/min离心5 min，分离血清，将其分成2小管，置于-20℃冰箱下保存，用于生化营养指标检测及酶联免疫吸附试验测定胰岛素、胰岛素样生长因子浓度。(2)心肌标本处理：取大鼠心肌组织，生理盐水冲洗2遍，去除表面水分及结缔组织，立刻置于固定液中，室温保存24 h后石蜡包埋，用于Masson染色。

1.6统计学分析 采用SPSS16.0软件进行t检验、单因素方差分析、q检验、χ2检验及Fisher确切概率法。

2 结 果

2.1动物的一般情况 注射ISO药物后90只大鼠死亡19只，大部分于注射药物12 h内死亡，死亡率为 21.1%。其中高剂量组死亡10只，死亡率33.3%；中等剂量组死亡6只，死亡率20.0%；低剂量组死亡3只，死亡率10.0%。3组比较有统计学差异(P<0.05)。而对照组无死亡。与对照组相比，注射ISO大鼠大部分出现口唇发绀，口中出现血性分泌物，皮毛发黄无光泽，活动量明显减少，体重无明显增加。

2.2超声心动图结果 与对照组相比，ISO组LVEDD、LVESD显著增大(P<0.05)，LVEF显著降低(P<0.05)，见表1、图1。进一步比较，高剂量组、中等剂量组的 LVEDD、LVESD与ISO组比较差异无统计学意义(P>0.05)；低剂量组 LVEDD、LVESD明显小于ISO组(P<0.05)；高剂量组、中等剂量组的LVEF明显低于ISO组(P<0.05)，但低剂量组与ISO组无统计学差异(P>0.05)。

表1 对照组与ISO组心功能比较

图1 对照组与ISO组超声心动图

2.3体重变化 注射药物前ISO组与对照组体重无统计学差异(P>0.05)，注射药物4 w后CC组体重显著低于心衰非恶病质组和对照组(P<0.05)，心衰非恶病质组低于对照组(P<0.05)，见表2。

2.4生化营养指标变化 总蛋白在CC组显著低于对照组(P<0.05)，与心衰非恶病质组比较无显著差异(P>0.05)，但心衰非恶病质组显著低于对照组(P<0.05)。三酰甘油、胆固醇在CC组显著高于非恶病质组和对照组(P<0.05)，但心衰非恶病质组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。血糖在CC组显著低于非恶病质组和对照组(P<0.05)，但心衰非恶病质组与对照组比较无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 各组体重及生化营养指标比较

2.5心肌组织病理学观察 ISO组心肌纤维排列紊乱，心肌细胞肥大且可见坏死消失，被大量纤维组织(绿色染色处)所取代，见图2。

图2 各组心肌组织(Masson染色，×100)

3 讨 论

CC是心衰后期出现的营养不良综合征，要想制作CC模型，首先需制作大鼠心衰模型。目前在实验研究中，大鼠模型常用的制作方法有药物注射法(ISO、阿霉素等)、结扎冠脉法、心脏超负荷法等〔4〕。大量的研究表明，通过小剂量长时间注射ISO建立心衰模型成功率高，大鼠死亡率低且操作简单易行，但时间较长，重复性较差〔5〕；也有研究用腹股沟皮下注射250 mg/(kg·d)ISO连续2 d制作心衰模型，但其死亡率较高并出现注射部位无菌性坏死〔6〕。本实验参考之前的研究探索3个级别ISO剂量制作模型的成功率，发现180 mg/(kg·d)、隔日1次、共2次注射ISO是最佳的剂量选择，该剂量组大鼠模型死亡率较低，注射部位未见明显无菌性坏死，并且超声心动图及心肌组织病理学结果均提示心衰模型建立成功，造模时间短，重复性好。

根据CC诊断标准，在心衰模型建立成功的前提下，其体重下降超过6%者才符合〔7〕。实验中所选大鼠在注射药物前体重相当，注射ISO 4 w后发现部分大鼠体重较对照组下降超过6%，说明心衰后期部分大鼠合并有恶病质的发生。类似的对癌性恶病质的研究也提到，只将体重下降程度作为判断大鼠是否进入恶病质状态不太准确，因此为了证实实验的分组是否合理，CC组是否进入恶病质状态，本研究还进行了生化营养指标测定，结果可以看出大鼠存在显著的营养不良和蛋白质、糖类、脂类代谢紊乱，低血糖可能与恶病质状态下肝脏糖原储备减少有关，而外周血胆固醇增加与脂肪组织分解增加相关〔8〕。研究证实心衰患者三酰甘油、胆固醇总量未发生明显改变，而亚油酸含量明显增高，花生四烯酸明显降低，即胆固醇酯中多不饱和脂肪酸发生了改变，导致其改善血管内皮功能及血管顺应性的功能下降，说明心衰患者仅存在脂肪酸代谢紊乱而尚未出现显著的脂类代谢紊乱〔9〕。相关的临床研究报道也提出胆固醇与心衰的发生相关性不大，而高密度脂蛋白、低密度脂蛋白与心衰的发生关系密切〔10〕。因此CC组与心衰非恶病质组间有明显差别，前者体内存在显著的脂类代谢紊乱。本研究可以看出心衰时总蛋白下降，而CC时总蛋白、血糖均显著降低，说明两者均存在营养不良，只是程度不同而已，两者血糖差异有统计学意义，可能与CC体内胰岛素水平异常升高有关。

总之，CC组与非恶病质组在三大物质代谢方面有显著差异，前者存在显著的营养不良和蛋白质、糖类、脂类代谢紊乱，明显处于恶病质状态，说明本研究的分组符合标准，证实了CC大鼠模型建立成功。