贲门腺癌组织中C20orf54的表达

贾瑞诺，李婉莹，李若楠，孔德九，孔金玉，高社干

1)河南科技大学第一附属医院 河南洛阳 471003 2)河南科技大学临床医学院 河南洛阳 471003 3)河南省肿瘤表现遗传重点实验室 河南洛阳 471003

贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma，GCA)是上消化道最常见的恶性肿瘤之一，发生在食管、胃交界线下约2 cm范围内，又称为食管-胃交界腺癌[1]。我国林州市及其毗邻区域是世界上食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和GCA发病率以及病死率最高的地区[2-3]。近年来GCA发病率明显上升[4-5]。研究[6-7]显示C20orf54是ESCC与GCA的重要遗传易感基因。C20orf54又称核黄素转运基因2，负责编码核黄素转运蛋白2，在核黄素的跨膜转运过程中起关键作用。核黄素缺乏已经被证实是我国ESCC与GCA高发的危险因素[6-9]。目前，C20orf54在GCA发生、进展过程中的作用尚不明确。本研究检测了C20orf54在GCA组织中的表达情况，并探讨其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2009年2月至2010年10月在河南科技大学第一附属医院确诊为原发性GCA的患者60例，其中男38例，女22例，年龄40～70(52.0±3.5)岁。所有患者均采用根治性手术治疗。选取手术切除癌组织及其癌旁正常贲门黏膜组织(距离癌组织5 cm以上)，若肿瘤边界越过贲门范围，则取正常胃黏膜，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2C20orf54mRNA的RT-PCR法检测应用Trizol试剂盒(加拿大Invitrogen公司产品)从GCA和癌旁正常黏膜组织中分别提取总RNA。按照说明书要求，利用PrimeScript试剂盒(TaKaRa公司产品)获得cDNA。利用SYBR Premix ExTaq Ⅱ(TaKaRa公司产品)和ABI PRISM 7300 系统(美国Applied Biosystems公司产品)检测C20orf54 mRNA的表达水平，以GAPDH为内参。C20orf54引物序列：上游5’-GGATACTGCTTAAGCTAGGCCTCGA-3’，下游5’-CCGGTATCGTACGTCACTAGTCGGTGG-3’。反应体系：MgCl2(25 mmol/L)4 μL，反转录10×缓冲液2 μL，dNTP混合物(10 mol/L)2 μL，重组RNasina核糖核酸酶抑制剂0.5 μL，AMV反转录酶15 μL，Oligo(dT)15引物0.5 μg，卡那霉素阳性对照RNA/总RNA 1 μg，加无核酸酶无离子水至总体积20 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，61 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，33个循环；72 ℃末次延伸5 min。利用凝胶成像分析系统GDS-8000扫描成像及拍照，以目的基因与GAPDH条带灰度值的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。

1.3C20orf54蛋白的Western blot法检测用RIPA裂解液裂解待测组织，提取总蛋白，120 g/L SDS-PAGE电泳分离总蛋白，转移至硝酸纤维素膜(美国MiLople公司产品)，30 g/L脱脂牛奶封闭，室温下孵育1.5 h，加C20orf54一抗(美国R&D公司产品，1∶200稀释)、Tubulin抗体(武汉艾美捷生物技术有限公司产品，1∶1 000稀释)孵育3 h。室温下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(武汉艾美捷生物技术有限公司产品，1∶18 000稀释)孵育1.5 h。采用增强化学发光检测系统观察蛋白条带，以Tubulin为内参。使用Image Pro Plus 6.0软件对结果进行分析。以目的蛋白与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.4C20orf54蛋白的免疫组化SP法检测GCA和癌旁正常黏膜组织常规切片、脱蜡、脱水、封闭血清，加一抗、二抗(同1.3)，DAB显色、苏木精复染、透明、封片，显微镜下观察。兔抗绵羊二步法免疫组化SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。随机观察5个视野(×200)，以胞质出现棕黄色染色为阳性细胞。按阳性细胞百分率评分：0%～为0分，5%～为1分，25%～为2分，≥75%为3分。按细胞质着色程度评分：未着色为0分，浅黄色着色为1分，棕黄色着色为2分，棕褐色着色为3分。两项得分相乘，<2分判为低表达，≥2分为高表达。

1.5随访从确诊为GCA的第1天开始采用门诊及电话的方式对患者进行随访，每3个月1次。随访截止时间为2013年12月31日。随访期间27例由于GCA相关的并发症或复发、远处转移死亡；失访1例。总生存期(OS)定义为从肿瘤确诊起至末次随访或者任何原因引起死亡的时间。

1.6统计学处理用SPSS 19.0进行分析。GCA组织和癌旁正常黏膜组织中C20orf54 mRNA、蛋白表达的比较采用配对t检验，蛋白高表达率比较采用配对χ2检验。不同临床病理特征GCA患者C20orf54蛋白表达的比较采用χ2检验。对C20orf54蛋白高表达和低表达GCA患者进行Kaplan-Meier生存分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1GCA和癌旁正常黏膜组织中C20orf54表达的比较见图1和表1。

T：GCA组织；N：癌旁正常黏膜组织

表1 GCA和癌旁正常黏膜组织中C20orf54的表达

2.2GCA和癌旁正常黏膜组织中C20orf54蛋白表达的免疫组化结果见图2和表2。

图2 GCA(A)和癌旁正常黏膜(B)组织中C20orf54蛋白的表达(SP，×200)

表2 GCA和癌旁正常黏膜组织中C20orf54蛋白表达的比较例

2.3不同临床病理特征GCA患者C20orf54蛋白表达的比较见表3。

表3 不同临床病理特征GCA患者C20orf54蛋白表达的比较

2.4C20orf54蛋白表达与GCA患者预后的关系C20orf54蛋白高表达和低表达GCA患者的Kaplan-Meier生存曲线见图3。C20orf54蛋白高表达组与低表达组的生存曲线差异有统计学意义(χ2=13.953，P<0.001)，中位生存期(T75,T25)分别是40.2(34.2,50.4)和23.1(14.4,29.8)个月。

图3 C20orf54蛋白高表达与低表达GCA患者的生存曲线

3 讨论

C20orf54基因定位于20p13，其mRNA全长2 716 bp(NM_033409.3)，共有5个外显子，编码一个由469个氨基酸组成的开放阅读框蛋白[10]。C20orf54被认为在人体吸收核黄素过程中起重要作用。C20orf54基因中多个位点突变会导致一种罕见的神经退行性疾病Brown-Vialetto-Van Laere syndrome(BVVLS)发生，细胞膜转运定位核黄素的能力减退或缺失，进而体内核黄素水平下降[11-13]。全基因组关联分析通过大样本检测SNP，发现C20orf54的一个SNP位点rs13042395是ESCC和GCA的易感基因位点[6-7]。研究[10]显示C20orf54基因可抑制ESCC细胞生长并促进其凋亡，在ESCC的发生发展中扮演着抑癌基因的角色。沈琼等[8]较早的研究表明，采用复合核黄素阻断治疗食管上皮重度增生，ESCC发病明显低于自然癌变率，长期使用复合核黄素可以降低ESCC的发病率和死亡率。

本研究结果显示GCA组织中C20orf54 mRNA及蛋白的表达较癌旁正常黏膜组织降低；在浸润深度T3、T4，中、低分化，有淋巴结转移和临床分期Ⅲ、Ⅳa期的GCA组织中，C20orf54蛋白高表达率明显下调；生存分析结果显示C20orf54高表达的GCA 患者预后优于低表达者。以上结果与既往研究结果[10,14]一致 。

综上所述，C20orf54可能是GCA发生发展进程中的保护因素，其表达下调或缺失可能促进GCA的发生、侵袭和转移，预示不良预后。