miR-219a-5p通过调控NEK6基因表达抑制视网膜母细胞瘤增殖、迁移和侵袭的机制

吴育芝 刘伟仙 林智

(1海口市第三人民医院眼耳鼻咽喉科，海南 海口 571100；2海南医学院第一附属医院眼科)

视网膜母细胞瘤(RB)是原发于视网膜的恶性肿瘤，对患者的视功能造成严重损害，严重时可危及生命〔1〕。由于发病初期，肿瘤体积较小且位于视网膜的周边，难以及时发现，易出现漏诊〔2〕。临床主要采用放疗、化疗、眼球摘除手术等方法进行治疗，虽然治疗方法不断改善，但治疗疗效依然有限〔3〕。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码单链小分子RNA，长度为18～25个核苷酸，可通过与靶基因互不结合调控靶基因的表达，在肿瘤的发生、发展中发挥调控作用〔4〕。研究显示，miR-219-5p在胶质母细胞瘤中表达下调，miR-219-5p过表达抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移，其靶向表皮生长因子受体(EGFR)表达调控RTK途径影响胶质瘤细胞的生物学功能〔5〕。miR-219-5p在黑素瘤组织和细胞系中表达显著降低，其低表达的黑素瘤预后较差，上调miR-219-5p表达可能通过靶向Bcl-2抑制黑素瘤细胞的生长和转移，并增强其化学敏感性〔6〕。目前，miR-219-5p在RB中的表达及对其增殖、迁移和侵袭的影响还未见报道。本研究探讨miR-219-5p在RB细胞Y79的表达情况及其对Y79细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞和实验试剂 人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181和人视网膜母细胞瘤细胞系Y79细胞，美国ATCC公司；胎牛血清和RPMI1640培养基，美国Gibco公司；Trizol试剂、PCR试剂盒和LipofectamineTM2000试剂盒，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒，TOYOBO公司；引物序列和质粒载体，广州市复能基因有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒，北京雷根生物技术有限公司；NEK6、周期蛋白依赖性激酶(CDK)1和细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体，美国Santa Cruz公司；基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和β-actin抗体，中国北京BIO-SYNTHESIS公司；辣根过氧化酶标记的二抗，Fermentas公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，北京百奥莱博科技有限公司。

1.2细胞培养和转染 Y79细胞和ACBRI-181细胞均使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，细胞融合至80%左右时，胰酶消化制成单细胞悬液，进行传代培养或用于后续实验。Y79细胞接种于6孔板内(1×105个/孔)，细胞融合度达60%时，采用脂质体法分别转染miR-con、miR-219a-5p mimics、si-con、si-NEK6及共转染miR-219a-5p mimics与pcDNA、miR-219a-5p mimics与pcDNA-NEK6。转染后12 h，更换新鲜含胎牛血清的RPMI1640培养基，继续培养至48 h，收集各组细胞用于后续实验。

1.3qRT-PCR检测miR-219a-5p和NEK6 mRNA表达 参照Trizol试剂操作说明提取细胞中总RNA，测定纯度和浓度之后，参照逆转录试剂盒操作说明逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按照PCR试剂盒说明进行扩增。反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。miR-219a-5p以U6为内参，NEK6以β-actin为内参，采用 2-△△Ct法计算miR-219a-5p和NEK6 mRNA的相对表达水平。

1.4Western印迹检测蛋白表达 加入细胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每个样本30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL显影，曝光拍照。Quantity One软件分析，以目的蛋白条带的灰度值和内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.5MTT检测细胞增殖 转染后的Y79细胞，以每孔103个细胞接种于96孔板中，每组设置3个复孔，置于培养箱中分别培养24、48和72 h。培养结束后，每孔加入20 μl MTT，继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，混合均匀，用酶标仪测定每孔在490 nm处的OD值。

1.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 细胞迁移实验：转染后的Y79细胞，用不含胎牛血清的RPMI1640培养基制成单细胞悬液，调整浓度为1×105个/ml，取100 μl直接加入 Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于培养基中培养48 h。取出小室，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，棉签擦去上室内层细胞，经甲醛固定、结晶紫染色后显微镜观察。随机选取5个视野计算细胞数，实验重复3次。细胞侵袭实验中Transwell小室的上室预先铺基质胶，其余与迁移实验操作相同。

1.7双荧光素酶报告基因实验验证 Target Scan等生物信息学软件预测结果显示，NEK6是miR-219a-5p的靶基因。分别构建野生型(WT)及突变型(MUT)NEK6 3′UTR的报告基因pGL3质粒，用脂质体法分别将NEK6 3′UTR-WT+miR-219a-5p mimics、NEK6 3′UTR-WT+miR-con、EK6 3′UTR-MUT+miR-219a-5p mimics、NEK6 3′UTR-MUT+miR-con转染至Y79细胞，48 h后，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-219a-5p和NEK6在人视网膜母细胞瘤细胞Y79与正常人视网膜血管内皮细胞ACBRI-181中的表达 与ACBRI-181细胞比，Y79细胞中miR-219a-5p表达水平显著降低(P<0.05)，NEK6 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图1，表1。

表1 miR-219a-5p和NEK6在Y79细胞和ACBRI-181细胞中的表达

图1 NEK6蛋白表达

2.2过表达miR-219a-5p对Y79细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-con组比，miR-219a-5p组Y79细胞miR-219a-5p表达水平显著升高(P<0.05)，说明miR-219a-5p过表达的Y79细胞构建成功。MTT结果显示，与miR-con组比，miR-219a-5p组Y79细胞培养48 h和72 h时，细胞OD值显著降低(P<0.05)。Transwell检测结果显示，与miR-con组比，miR-219a-5p组Y79细胞迁移和侵袭数均显著降低(P<0.05)，见图2，表2。

图2 Y79细胞迁移和侵袭的细胞数(结晶紫，×100)

表2 抑制miR-219a-5p表达对Y79细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.3miR-219a-5p过表达对Y79细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 与miR-con组比，miR-219a-5p组Y79细胞CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图3，表3。

图3 Y79细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达

表3 miR-219a-5p过表达对Y79细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

2.4miR-219a-5p靶向调控NEK6的表达 Target Scan在线靶基因预测工具显示，NEK6的3′UTR中含有与miR-219a-5p互补的核苷酸序列(图4)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-219a-5p+NEK6-WT组荧光素酶活性(0.58±0.08)显著低于miR-con+NEK6-WT组(1.00±0.11；t=9.264,P=0.000)，而miR-219a-5p+NEK6-MUT组与miR-con+NEK6-MUT组荧光素酶活性(1.16±0.16、0.93±0.09)差异无统计学意义(P>0.05)，说明miR-219a-5p靶向调控NEK6表达。与miR-con组(0.53±0.06)比，miR-219a-5p组Y79细胞中NEK6蛋白(0.19±0.03)显著降低(P<0.05)；而与anti-miR-con组(0.63±0.07)比，anti-miR-219a-5p组(0.81±0.09)显著升高(P<0.05)，进一步说明miR-219a-5p在Y79细胞中靶向负调控NEK6表达。

1～4：miR-con、miR-219a-5p、anti-miR-con、anti-miRV219a-5p图4 NEK6的3′UTR中含有与miR-219a-5p互补的核苷酸序列

2.5抑制NEK6表达对Y79细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与si-con组比，si-NEK6组Y79细胞NEK6蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，培养后48 h和72 h细胞OD值显著降低(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数均显著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，见图5，表4。

图5 Y79细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达

表4 抑制NEK6表达对Y79细胞增殖、迁移、侵袭及其相关蛋白的作用

2.6miR-219a-5p和NEK6表达对Y79细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与miR-219a-5p+pcDNA组比，miR-219a-5p+pcDNA-NEK6组Y79细胞NEK6蛋白表达显著升高(P<0.05)。与miR-219a-5p+pcDNA组比，miR-219a-5p+pcDNA-NEK6组Y79细胞培养48 h和72 h细胞OD值显著升高(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数均显著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。见表5,图6。

表5 miR-219a-5p和NEK6表达对Y79细胞增殖、迁移和侵袭及其相关蛋白的作用

1～4：miR-con组、miR-291a-5p组、miR-291a-5p+pcDNA组、miR-291a-5p+pcDNA-NEK6组图6 Y79细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达

3 讨 论

RB是一种常见的眼内恶性肿瘤，多发生于儿童时期，约占儿童恶性肿瘤的3%〔7〕。由于早起诊断的局限性，儿童期肿瘤的死亡率较高〔8〕。多种miRNA在RB中表达异常，参与RB的发生和发展。miR-29a在RB组织和细胞系中表达下调，其过表达显著抑制RB细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进RB细胞凋亡，miR-29a可能通过抑制STAT3对RB发挥肿瘤抑制作用〔9〕。miR-613在RB组织和细胞系中表达降低，miR-613过表达抑制RB细胞增殖、迁移和侵袭，并在体外诱导细胞周期停滞，miR-613通过下调E2F5在RB中起肿瘤抑制剂作用〔10〕。

miR-219-5p是一个与肿瘤高度相关的miRNA家族成员，目前已被证实其在非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌等多种肿瘤中异常表达〔11～13〕，影响肿瘤细胞的生物学功能，参与肿瘤的发生发展。本研究结果提示，miR-219-5p作为肿瘤抑制因子在RB中发挥作用，可能是RB治疗的潜在靶点。细胞增殖依赖于细胞周期，Cyclin和CDK是调控细胞周期的重要蛋白〔14〕。细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤细胞迁移和侵袭的基础。MMP是一类能降解细胞外基质和基底膜的酶类，可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭〔15〕。本研究结果提示，miR-219-5p能调控与Y79细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白的表达。

miRNA在肿瘤疾病中通过调控其下游靶基因表达发挥生物学作用〔16〕。Target Scan等靶基因在线预测工具显示，miR-219a-5p可与NEK6的3′UTR中核苷酸序列互补结合，猜测miR-219a-5p可靶向调控NEK6表达。双荧光素酶报告基因实验证实了Y79细胞中miR-219a-5p靶向调控NEK6的表达。本研究结果说明miR-219a-5p靶向负调控NEK6表达。NEK6参与调控细胞周期〔17〕，研究显示，NEK6在胃癌组织和细胞系中表达上调，与患者远处转移、淋巴结转移和TNM分期等密切相关，下调NEK6表达可有效降低胃癌细胞的迁移和侵袭能力〔18〕。本研究结果与相关报道结果一致〔19〕，提示NEK6作为促肿瘤因子在RB中起重要作用，抑制其表达有助于RB的治疗。研究还发现，NEK6过表达部分逆转了miR-219a-5p过表达对Y79细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步说明miR-219a-5p通过调控NEK6表达在RB中发挥肿瘤抑制作用。