Fe3O4纳米酶对白念珠菌的体外抑制实验研究

王昊珏 房灵 崔成军 施启丰 陆胜 陆显义 高利增

1无锡市锡山人民医院妇产科214105；2无锡市锡山人民医院皮肤科214105；3无锡市锡山人民医院病理科214105；4无锡市锡山人民医院检验科214105；5扬州大学转化医学研究院225012

纳米酶是具有类酶催化活性的纳米材料，属于新一代人工模拟酶。具有过氧化物酶或氧化酶活性的纳米酶可以抑制多种细菌如大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和变形链球菌的生长［1-2］。我们之前的工作发现，Fe3O4纳米酶具有过氧化物酶活性，可以分解H2O2生成自由基，在酸性条件下，通过诱导高水平的活性氧（ROS），杀死细菌，破坏生物膜的形成［3］，有望作为一种新型的抑菌制剂。本研究观察Fe3O4纳米酶对体外白念珠菌的作用，以期为白念珠菌感染的治疗提供新的选择。

一、材料与仪器

氯化铁、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、聚乙二醇、乙二醇（美国Sigma公司），醋酸钠、戊二醛、30%H2O2［生工生物工程（上海）股份有限公司］。白念珠菌标准株（编号：AF206001，批号：20170721）购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

二、方法

1.纳米酶的制备与表征：以水热合成法［4-6］为基础，适当改进后制备Fe3O4纳米酶。取0.82 g 无水氯化铁溶于40 ml乙二醇和聚乙二醇（1∶3）溶液中，缓慢加入3.6 g 三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液，超声震荡，充分混匀。将溶液转移至50 ml聚四氟乙烯反应釜，于200 ℃下加热12 h，自然冷却至室温后，得到黑色沉淀物。采用乙醇和水分别洗涤产物3 次，于60 ℃干燥3 h 得到Fe3O4纳米颗粒。取适量Fe3O4纳米颗粒均匀分散在水溶液中，滴加于硅片上，常温干燥后，扫描电镜和透射电镜观察形貌。

2.白念珠菌培养及处理：配制沙氏固体培养基（含蛋白胨、琼脂、葡萄糖）、沙氏液体培养基（含蛋白胨、葡萄糖）。采用沙氏液体培养基稀释50 μl白念珠菌菌液至5 ml，37 ℃震荡培养24 h，使用沙氏液体培养基稀释菌液至106CFU/ml作为标准菌悬液备用。根据本课题组前期实验基础［4］，采用0.5 g/L Fe3O4纳米酶和0.1%H2O2与菌液共培养，分为纳米酶组、H2O2组、联合组（纳米酶+H2O2共处理），以未做处理菌液为对照组。

3.纳米酶对白念珠菌生长的抑制作用：挑取4 组白念珠菌单克隆接种于5 ml 沙氏培养液，恒温摇床震荡培养过夜。1∶100转接，每隔2 h检测600 nm处吸光度（A值），绘制白念珠菌生长曲线。每次设置3个平衡，取平均值。

4.纳米酶对体外白念珠菌生长的影响：采用平板稀释法，取4 组菌液于4 只1.5 ml 无菌EP 管，处理2 h 后10 倍稀释，混匀涂板，于36 ℃培养48 h，观察菌落形成情况并计数。抑菌率=（对照组菌落数-实验组菌落数）/对照组菌落数×100%。实验重复3次。

5. 扫描电镜观察纳米酶对白念珠菌形态的影响：取4 组经过处理2 h后的菌液5 ml，4 000 r/min离心（离心半径6 cm）3 ～5 min，生理NaCl溶液清洗3遍，弃上清液，2.5%戊二醛固定，于4 ℃冰箱中固定2 h 以上，生理NaCl 溶液冲洗2 ～3遍。采用梯度浓度的乙醇溶液脱水，经干燥、黏样、喷金导电后，采用扫描电镜观察、拍照。

6. 统计学方法：采用GraphPad Prism7 软件，计量资料采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.Fe3O4纳米酶的形态：透射电镜下观察到大量单个分散的黑色纳米酶颗粒，大致呈圆形，表面有大小一致的小突起，粒径均匀，平均直径约120 nm。见图1。

2.纳米酶对白念珠菌生长的影响：白念珠菌前22 h 处于生长的稳定期，22 h后进入对数生长期，36 h时进入平台期。联合组白念珠菌前2 h有生长，后均受到抑制。见图2。

对照组、H2O2组、Fe3O4纳米酶组、联合组的菌落计数分别为124 830 ± 45 170、86 330 ± 13 960、91 670 ± 31 370、30 330±3 010，差异有统计学意义（F=9.41，P ＜0.05），联合组低于对照组、H2O2组、纳米酶组（t=4.63、8.08、4.27，P ＜0.05），H2O2组、纳米酶组和对照组相比差异无统计学意义（t=1.82、1.34，P ＞0.05）。

H2O2组、纳米酶组、联合组的抑菌率分别为30.84% ±5.00%、26.57%±11.24%、75.70%±2.42%，差异有统计学意义（F=9.413，P=0.0004），联合组抑菌率高于H2O2组、纳米酶组，差异有统计学意义（t=8.08、4.27，P ＜0.05）；H2O2组与纳米酶组差异无统计学意义（t=0.35、4.27，P=0.74）。

3.纳米酶对白念珠菌形态的影响：处理2 h后扫描电镜观察，对照组白念珠菌菌体饱满，可见出芽生殖；H2O2组、Fe3O4纳米酶组可见菌体稍皱缩；联合组菌体明显变形、崩解。见图3。

四、讨论

图1 电镜下纳米酶颗粒形态 1A：扫描电镜下为单个分散的黑色纳米酶颗粒，大致呈圆形，尺寸均一（×4 000）；1B：透射电镜下平均直径为120 nm的颗粒，表面有大小一致的小突起（×5 000）

图2 不同处理条件下白念珠菌生长曲线 对照组白念珠菌前22 h处于生长的稳定期，22 h后进入对数生长期，36 h时进入平台期。纳米酶组、H2O2组、联合组白念珠菌的生长均受到抑制

图3 扫描电镜观察各组白念珠菌形态 3A：对照组见白念珠菌细胞呈圆形或卵圆形，可见出芽，直径3 ～6 μm；3B：H2O2组见菌丝萎缩，活性减退；3C：纳米酶组见菌丝进一步萎缩，活性减退；3D：联合组见菌丝裂解成碎屑状

纳米酶是一类新型的模拟酶，有特殊的抗菌作用。3% H2O2是常用的杀菌消毒剂，它能分解产生自由基，破坏细菌的细胞膜、蛋白质、核酸等活性组分，H2O2酶可加速产生自由基的效率。具有过氧化物模拟酶活性的纳米材料就可有类似作用，提高H2O2产生自由基的效率，增强杀菌消毒的效果［7］。Falsetta 等［8］发现，纳米铁能损毁细菌生物膜，对口腔内耐药细菌具有较好的抑制作用，并在酸性环境中（pH 4.5 ～4.7）更加有效。在低浓度H2O2存在时，微量的纳米酶即可杀灭100%大肠杆菌，而单独使用H2O2杀菌效率低于15%［9］。

本研究采用水热合成法制备Fe3O4纳米酶颗粒，电镜下观察到Fe3O4纳米酶大致呈圆形，表面有大小一致的小突起，粒径均匀，平均直径约120 nm，将其联合H2O2作用于体外培养的白念珠菌，计算其抑菌率，并在电镜下观察白念珠菌形态。结果显示，对照组白念珠菌具有相对稳定的生存曲线，而纳米酶组、H2O2组、联合组白念珠菌的生长均受到抑制，单用H2O2或纳米酶对白念珠菌的抑菌率为30%左右，而联合组可达75.70%，抑菌效力明显增强。电镜下观察4 组白念珠菌的形态发现，经过Fe3O4纳米酶、H2O2作用的白念珠菌活性减退，而联合组白念珠菌发生了崩解，提示Fe3O4纳米酶联合H2O2具有较强的抗白念珠菌能力。

基于本试验结果，Fe3O4纳米酶可能会成为一种全新的不同于其他药物的抗菌制剂，从而用于白念珠菌感染的治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突