非小细胞肺癌循环肿瘤DNA突变特征与放疗敏感相关性研究*

罗成, 吴川, 方曾怡, 高明权, 吴自飞, 王卫东

646000 四川 泸州，西南医科大学附属医院 肿瘤科(罗成、吴川、方曾怡、王卫东)；610054 成都，电子科技大学 医学院(高明权、吴自飞)；610041 成都， 四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院，放射肿瘤学四川省重点实验室 放射治疗中心(王卫东)

探索一种能准确及时反映肺癌放疗敏感性的特异性标志物，将会对肺癌个体化治疗策略的制定及修正具有重要的临床意义[1]。肿瘤基因变异及多态性差异与放射敏感性密切相关。基因不仅可以预测肿瘤放射敏感性，还可成为改善肿瘤放射敏感性的靶点，为肿瘤放射增敏提供新思路[2]，对肿瘤基因突变及差异表达的研究是放射敏感性研究的重要方向。外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是液体活检的重要手段，它包含肿瘤细胞的全部基因突变信息，在肺癌的早期诊断、疗效评估、用药指导、预后预测及复发监控方面具有独特的优势[3]。ctDNA突变特征类型包括单核苷酸突变(single nucleotide variant,SNV)，小片段插入/缺失(insertion and deletion,Iad)，拷贝数变异(copy number variation,CNV)3种[4-6]。目前国内尚未报道过非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)ctDNA突变特征与放射敏感性之间的关联性。因此，本研究通过高通量测序技术检测NSCLC患者外周血ctDNA的基因突变特征，并与肿瘤等效退缩率(equivalent tumor regression rate,ETRR)进行相关性分析，初步研究外周血ctDNA在NSCLC中的突变特征谱及其与放射敏感的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

前瞻性纳入2017～2019年在四川省肿瘤医院初治的NSCLC患者，入组标准：1)病理提示为NSCLC；2)有影像学可评估的肺部病灶；3)卡氏评分≥70分，预计生存期>6月；4)全程采用调强放疗技术；5)完成全部放疗计划。排除标准：1)合并严重肺部疾病，一氧化碳弥散功能占预计值的百分比<60%；2)合并严重心、脑血管及肝肾疾病；3)严重贫血，血红蛋白<80 g/L；4)年龄<18岁或>80岁；5)有放射治疗其他禁忌症。

所有患者统一使用医科达或瓦里安系统医用直线加速器，采用6MV X线能量，剂量率400～600 cGy/min，全程采用调强放疗技术，处方剂量:(45～75)Gy/(15～33)f，单次分割剂量2.0～3.55 Gy/f，5 f/w。所有入组患者根据ICRU-62指南在胸部定位增强CT肺窗上勾画肿瘤原发病灶体积(gross tumor volume tumour,GTV-T)，预先设定窗宽、窗位分别为1 600 Hu和-600 Hu，有毛刺时仅勾画毛刺根部，胸膜凹陷处包入靶区内，粘液栓不包入靶区内。纵隔病变在纵隔窗勾画，设定窗宽、窗位分别为400 Hu和20 Hu，阳性淋巴结定义短径>1 cm/短径≤1 cm，但有>5个的小淋巴结成团或成簇出现。临床靶区为根据病理类型由GTV外扩0.6(鳞癌)～0.8 cm(腺癌)区域。同时勾画正常肺组织、食管、脊髓及心脏等危及器官，并根据RTOG 0225实验协议要求设定危及器官限制剂量。

1.2 ETRR计算及分组

在肺窗上勾画GTV-T后，由MIMO计算机系统计算肿瘤体积值，作为放疗前肿瘤基线体积，并定义为V0，放疗结束后1月复查定位增强CT，再次按上述靶区勾画原则，勾画放疗后的原发肿瘤残留体积，并定义为V1。按照肿瘤退缩率(tumor regression rate,TRR)公式[TRR=(V0-V1)/V0×100%][7]，计算样本的TRR,其数值可以间接反映肿瘤对放射治疗的敏感性(胸部增强CT显示NSCLC样本放射治疗前后肿瘤体积变化情况如图1所示)。考虑到临床中患者接受放疗剂量的差异，我们将TRR与生物效应剂量(biological effective dose,BED)的比值，其中BED=n×d×[1+d/(α/β)],n为分次数,d为分次剂量,α/β值取10[8]，来对放疗剂量进行标化处理，我们定义这个值为ETRR，即ETRR=TRR/BED，得到20例肿瘤样本的等效退缩率分布图，这样避免了放疗剂量差异对疗效观察的影响，使结果更加准确可靠(图2)。

图1 3例代表性NSCLC患者放疗前后胸部CT图像

肿瘤临床评效标准参照RECIST 1.1的标准进行，治疗后肿瘤体积退缩30%及以上定义为敏感组，退缩不足30%定义为抵抗组。

图2 等效退缩率直条图

1.3 ctDNA样本提取及检测方法

统一采用EDTA抗凝管采集空腹外周肘静脉血液，时间节点分别选择患者放射治疗前1周内及治疗结束后4周。将采集的血液于2 h内进行处理，在4℃环境下静置，进行血浆及白细胞分离，采用循环核酸提取试剂盒提取血浆ctDNA，将样本中DNA浓度≥20 ng/μL，总量0.6 μg以上的DNA样品用来建库，将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180～280 bp的片段，捕获实验采用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒，末端修复、磷酸化以及加A尾后，片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异标签序列index的文库与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将20 965个基因的334 378个外显子捕获下来，经PCR线性扩增后进行文库质检[链霉素磁珠杂交捕获原理(北京诺禾致源公司)见图3]，合格后进行Illumina HiSeq PE150高通量双端测序。具体建库测序流程见图4。同时通过基因测序技术准确获得肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB),即外显子编码区每兆碱基中发生基因突变的总数。

1.4 统计学分析

相关数据处理采用SPSS 17.0软件，两组间计量资料符合正态分布者采用t检验，不符合正态分布者采用秩和检验，P<0.05表示差异具有统计学意义，进一步对有统计学意义的数据行Spearman秩相关分析。

图3 杂交捕获原理

图4 建库测序流程

2 结 果

2.1 患者临床特点及分组

总入组35例患者，7例于放疗前放弃治疗，5例在治疗中放弃治疗，最后完成全部放疗计划的患者总计23例。 年龄最大的77岁，最小的48岁；男性18例，女性5例；腺癌8例，鳞癌15例；II期1例，III期11例，IV期11例。其中1例在治疗过程中出现肺部严重感染，胸腔积液，放疗被迫中断，待感染控制后断续完成放射治疗，总放疗持续时间>8周；2例在放疗开始前1周内完成了铂类为基础的双药联合化疗。

为了避免铂类化疗药物对TMB、基因编码和潜在驱动突变的影响[9]，以及放疗中断时间过长，肿瘤增殖对肿瘤退缩的影响，我们在进行疗效分析时，排除2例接受化疗的样本和1例放疗中断时间过长的样本，对剩下的20例样本进行分析。

将整体受照物理剂量按公式换算成BED，所得数据服从正态分布。利用统计学分析得到平均BED为70.47±11.35，按照30%比上平均BED转换成ETRR的敏感临界值为0.43%，小于0.43%为抵抗组，大于或等于0.43%为敏感组。最后，20例样本分成敏感组13例，抵抗组7例。

2.2 SNV与ETRR的相关性分析

SNV主要包括外显子编码区域突变，内含子区域突变，3’UTR和5’UTR区域突变，剪切位点4bp区域突变，非编码RNA区域突变，基因间隔区突变等，其中以外显子编码区域错义突变为主，约占70%，另有部分同义突变，约占25%，而由于插入、删除或连续碱基替换导致变异位点产生一个新的终止密码子或终止密码子丢失的非同义突变类型和未知突变仅占约5%，本文中我们将此类型与错义突变一起统称为非同义突变。分别将SNV总数(SNV total,SNVT)、SNV中非同义突变总数(SNV nonsynonymous total,SNVNT)、SNV中非编码RNA突变总数(SNV non-coding RNA total,SNVNRT)、3’UTR和5’UTR区域突变数(UTR total, UTRT)、剪切位点4bp区域突变数(splicing total, ST)进行t检验，结果显示两组样本之间差异无统计学意义(P>0.05),可以认为SNV中的上述观察指标在放射治疗敏感组和抵抗组之间无差异(表1)。

表1 SNV t检验结果

2.3 基因Iad突变与ETRR的相关性分析

20例样本测序结果显示基因小片段的插入/缺失突变非常少，这可能与DNA经破碎仪处理后50 bp以内的小片段太短，采用二代测序方法时，能检测出的数量太少有关。本文不再进一步对此类突变进行分析。

2.4 基因CNV与ETRR的相关性分析

CNV可分为缺失和重复两种类型，每种类型又有变异数目的多少和区域的大小之分。测序结果显示基因CNV两种类型均存在，并且重复和缺失可以在同一样本的不同位点上发生。在CNV数目方面，主要表现为拷贝数重复的数目多于缺失的数目，但变异数目的多少与区域的大小无绝对正相关性。分析拷贝数变异类型、总数目、总区域大小、重复数和缺失数及其区域大小，进行正态性检验后服从正态分布者采用t检验，不服从正态分布数据采用秩和检验，结果显示，敏感组和抵抗组基因拷贝数变异的总数(CNV total count)、类型、变异重复数(CNV duplication count)、变异缺失数(CNV deletion count)及变异缺失区域大小(CNV deletion region size)无统计学差异(P>0.05)，但两组样本拷贝数变异总区域大小(CNV total region size)及重复区域大小(CNV duplication region size)有统计学差异(P=0.014,P=0.008)。进一步进行Spearman秩相关分析显示秩相关系数rs>0(rs=0.554,0.591)，为正相关，即变异重复区域越大，对放射治疗敏感性越低(表2～4)。

表2 CNV和TMB t检验结果

表3 CNV秩和检验结果

表4 CNV秩相关分析结果

2.5 TMB与ETRR的相关性分析

TMB在敏感组为(36.63±14.42)mutations/mb，抵抗组为(33.92±9.78)mutations/mb，将敏感组和抵抗组TMB行t检验，结果显示两组样本的均数差异无统计学意义(P>0.05)，认为TMB与放射治疗敏感无相关性(表2)。

3 讨 论

本研究测序结果显示，NSCLC患者的ctDNA突变特征主要表现为以下几方面：体细胞突变几乎均存在SNV、Iad及CNV三种类型，其中Iad类型较少见，这可能与DNA经破碎仪处理后的片段中低于50 bp的小片段较少有关，而SNV及CNV相对常见，SNV是基因组中种类最丰富的变异，其中以外显子编码区域错义突变为主，另外还有部分内含子区域，非翻译区域，剪切位点4 bp区域，非编码RNA区域及间隔区域突变。

本研究重点观察SNV总数、非同义突变数、非编码RNA突变数、非翻译区突变数、剪切位点4bp区突变数在放射敏感组与抵抗组的差异表达情况，结果显示其在两组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。李健强等[10]采用病例对照方法分析NSCLC患者p53基因BstU Ⅰ位点的多态性与放疗疗效的相关性，发现p53基因BstU Ⅰ单核苷酸多态性可能与放射敏感性有关。而本研究重点研究体细胞突变，未对单核苷酸多态性进行深层次基因分析，但这给今后的研究提供了思路。Lin等[11]的研究已经证实了3’UTR区域的突变影响miRNA与基因的结合，导致基因的调控产生异常，影响NSCLC患者的总体生存。非编码RNA尽管也不编码蛋白质，但它们不仅参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、调控细胞周期、黏附、诱导血管生成等多种生物学行为，而且在染色质重塑、转录调控和转录后加工等多层面调控基因表达，在肿瘤的诊断及治疗方面有着重要的作用[12]。Wolfort等[13]发现，真核细胞翻译起始因子4E在乳腺癌中高表达可能与放疗抵抗有关。孙献涛等[14]发现非编码RNA的强制表达通过促进细胞凋亡提高结直肠癌对放射治疗的敏感性。剪切位点4bp突变也可以通过影响RNA的剪接，从而影响蛋白的表达[15]。但关于SNV中非同义突变、非编码区RNA突变及剪切位点4bp区域突变与肺癌放射敏感性的研究目前尚未有相关报道，本研究也只是初步从整体突变数量方面进行探讨，仍有待后续深入研究。另外，尽管Lin等[11]的研究证实3’UTR区突变与NSCLC的总体生存相关，但影响总体生存的因素较多，非翻译区突变与放射敏感性的关系仍需进一步证实。

本研究对CNV的分析发现，拷贝数多以重复为主，但大多同时伴有拷贝数的缺失，且变异数目的多少与区域的大小并无绝对相关性，进一步分析变异总数目、重复或缺失的数目与放射治疗敏感无相关性(P>0.05)，但变异总区域的大小，尤其是重复区域的大小与肿瘤对放射治疗的敏感具有相关性(P<0.05)，且肿瘤变异区域越大，越容易对放射治疗产生抵抗。根据肿瘤分子生物学特点，癌基因多位于拷贝数重复的区域中，抑癌基因可能更多位于缺失的区域中。拷贝数重复区域癌基因的激活，使得DNA的修复能力增强，使机体对治疗的耐受性增加；反之，拷贝数减少，DNA修复能力下降，更有利于对预后产生好的影响[16]。而汪弋汀等[17]通过大数据分析后发现放疗抵抗与CNV缺失有关，放疗敏感与CNV扩增具有一定相关性。这与本研究的结论差异可能与数据分析时样本的选择偏倚有关。汪弋汀等是从TCGA数据库中提取的标本，最后纳入38例进行研究，其中36例为术后患者，23例进行瘤床照射，13例行区域淋巴结照射，而本研究全部进行的肺部可见病灶的照射。

理论上，TMB表达水平高者可以通过T细胞介导的抗肿瘤效应增强肿瘤对放射治疗的敏感性，但我们的结果与这一结论不一致，本研究发现敏感组和非敏感组之间TMB并无明显差别。这可能与两方面原因有关：1)TMB表达水平受年龄影响较大，使结果产生偏差；2)实际上只有能够产生激发免疫反应的免疫性抗原的基因突变的数量越多，即非同义突变越多，才能产生更多的新抗原，以被T细胞识别，激发更强抗肿瘤效应[18]。所以尽管部分TMB表达水平很高，但能激发免疫性抗原的基因突变的数量较少，表现对放射治疗仍然是不敏感。

本研究采集外周血进行二代高通量测序检测ctDNA突变频率及图谱，筛选疗效评估及预后监测的重要指标。同时，也引入了一个ETRR的概念，用来间接评估肿瘤对放射治疗的敏感性，这种处理使研究结果更加准确可靠。但本研究也有如下缺陷：1)血液采集的时间节点及CT评估肿瘤基线体积和残留体积的时间节点有待进一步精准和细化；2)样本接受放射治疗的剂量有待更标准化；3)纳入研究的样本仅20例，可能缺乏足够的统计学效力。下一步我们将筛查出CNV重复的区域，寻找重复区域的具体位点和基因；从ctDNA突变特征中寻找肿瘤驱动基因及高频突变基因，进一步分析与放疗敏感性相关的突变基因及其代谢通路。

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