响应曲面法优化雷公藤甲素的微波萃取工艺

曾晶，朱龙

（1.湘南学院基础医学院，湖南郴州，423000；2.深圳东阳光药业有限公司，广东深圳，518000）

雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook F，TwHF）又名黄藤根、断肠草、菜虫药、南蛇根和旱禾花等，为卫矛科雷公藤属植物，是一个有着上千年应用历史的中药。其主要活性成分雷公藤甲素（Triptolide，TPL）是一种环氧二萜内酯化合物[1-3]，结构式见图1。大量体内和体外的研究证明，雷公藤甲素具有抗炎、免疫抑制、抗癌和抗HIV病毒等药理作用，在临床上治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和肾病综合症等疾病疗效显著[4-5]。

图1 雷公藤甲素的结构式

近年来，越来越多的研究集中于雷公藤甲素提取方法的优化，目前普遍采用的方法为水提醇沉法、乙酸乙酯和氯仿等有机溶剂萃取[6-7]。然而，这些方法具有产量低、污染大、程序复杂和耗时长等缺点[8-10]。为提高产品的回收率和资源的利用率，本实验采用微波辅助萃取法对雷公藤甲素进行提取分离，并在单因素试验的基础上，进一步通过响应曲面法（Response surfacemethodology，RSM）优化微波萃取过程中的各因素，为规模生产提供有价值的工艺参数，以促进新药的开发。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

LC-20AD高效液相色谱仪，日本岛津，G80F20CN2L-B8RO型微波炉，格兰仕微波炉电器有限公司，RE－3000D型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂，十万分之一电子天平，梅特勒-托利多公司。

1.2 样品和试剂

雷公藤（湖南蜂祥中药材有限公司）；雷公藤甲素对照品，纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司；乙腈，色谱纯，上海阿拉丁；乙醇（上海阿拉丁）等其他试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品制备

将雷公藤干燥根粉碎后过60目筛，得到雷公藤粉末。称取雷公藤粉末1.00 g，加入一定量乙醇溶剂，按照不同的料液比、萃取时间进行微波萃取、离心，吸取上清液旋转蒸发干燥，采用中性氧化铝层析柱进行富集。

1.3.2 高效液相色谱检测条件

Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A：水；流动相B：乙腈。洗脱梯度：0～24 min，10%～50% B；24～25 min，50～10% B，25～30 min，10% B，检测波长218 nm，柱温为室温，流速1 mL/min，进样量20 μL。

1.3.3 标准曲线的绘制

精密称取雷公藤甲素对照品7.0 mg，加入50%乙腈水溶液制成7 mg/mL的储备液。再逐级稀释，最终得到浓度分别为 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL和80 μg/mL的对照品溶液。按2.2项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线为Y=2.137×106x+576.8（R2=0.998 2），在 5～80 μg/mL线性良好。

1.3.4 单因素试验

选择乙醇体积分数、料液比和微波时间这3个因素，考察其对雷公藤甲素得率的影响。其中，乙醇体积分数设置60%、70%、80%、90%和99.5%共5个水平；料液比设置1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g∶mL）共5个水平；微波时间设置4 min、6 min、8 min、10 min和12 min共5个水平。

2.5 响应曲面法优化雷公藤甲素提取工艺

以雷公藤甲素萃取得率为考查指标，在单因素试验基础上，以乙醇体积分数、料液比、微波时间为试验因素，每因素选取3个水平进行响应曲面设计试验。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用Design-Expert 10.0.7进行三因素三水平的响应面分析法优化雷公藤甲素的提取工艺参数，试验因素及水平见表1。

表1 试验因素与水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

乙醇体积分数对雷公藤甲素提取效果的影响如图2所示，当乙醇体积分数不断增大时，雷公藤甲素的得率先增大后减小，乙醇体积分数为80%时，得率最高。其原因可能是当乙醇体积分数较小时，雷公藤甲素的溶解度随着乙醇体积分数的增大而增大，但乙醇体积分数较大时，溶剂极性变小，雷公藤甲素溶解度降低。

料液比对雷公藤甲素提取效果的影响如图3所示。在雷公藤粉末质量一定的情况下，随着提取液体积的不断增大，雷公藤甲素的得率先增大后趋于平缓，当料液比为1∶15（g/mL）时，得率最大。其原因可能是随着溶剂用量的增加，溶于溶剂中的雷公藤甲素增多，但溶剂用量达到一定值后，溶于溶剂中的雷公藤甲素的量不再改变。

图2 乙醇体积分数对雷公藤甲素得率的影响

图3 料液比对雷公藤甲素得率的影响

微波时间对雷公藤甲素提取效果的影响如图4所示，随着微波时间的不断增大，雷公藤甲素的得率先增大后减小，可能是因为温度升高会导致分子热运动加快，有利于雷公藤甲素的提取，但时间过长，则会导致雷公藤甲素分解。当微波时间为8 min时，有最大得率。

图4 微波时间对雷公藤甲素得率的影响

2.2 雷公藤甲素提取响应面分析试验结果

以雷公藤甲素得率为响应值，利用Design-Expert 10.0.7软件进行分析，得到回归方程为：得率=1.19+0.078A+0.076B+0.15C-0.027AB-8.75×10-3AC+0.016BC-0.11A2–0.09B2–0.044C2，方差分析结果如表2所示。

由表2可知，影响雷公藤甲素得率的因素顺序为：微波时间＞乙醇体积分数＞料液比。其中，微波时间为极显著因素，乙醇体积分数和料液比为显著因素，整体模型达到了极显著水平（P＜0.01）。模型的R2为0.913 3，失拟项不显著（P＞0.05），说明试验模型拟合充分，可靠性高。

表2 回归模型方差分析结果

各因素对响应值的影响可通过响应曲面表示，结果见图5～7。从图5可看出，当料液比固定不变时，雷公藤甲素得率随着乙醇体积分数的增大出现先升高后降低的趋势；当乙醇体积分数固定不变时，雷公藤甲素得率随着料液比的增大而增大。当乙醇体积分数为76%～95%，料液比为1∶（14～23）时，雷公藤甲素得率接近最大值。

图5 乙醇体积分数和料液比对雷公藤甲素得率的交互影响

由图6可见，当微波时间固定不变时，雷公藤甲素得率随着乙醇体积分数的增大出现先升高后降低的趋势；当乙醇体积分数固定不变时，雷公藤甲素得率随着微波时间的增大出现先升高后降低的趋势。当乙醇体积分数为76%～95%，微波时间在7～10 min时，雷公藤甲素得率接近最大值。

图6 乙醇体积分数和微波时间对雷公藤甲素得率的交互影响

由图7可见，当微波时间固定不变时，雷公藤甲素得率随着料液比的增大而增大；当料液比固定不变时，雷公藤甲素得率随着微波时间的增大出现先升高后降低的趋势。当料液比为1∶（14～23），微波时间为7～10 min时，雷公藤甲素得率接近最大值。

图7 料液比和微波时间对雷公藤甲素得率的交互影响

通过Design-Expert 10.0.7软件得到雷公藤甲素的最佳微波提取条件为：乙醇体积分数84.9%，料液比1∶19.7，微波时间7 min。考虑实际操作的可行性，确定最佳提取条件为：乙醇体积分数85%，料液比1∶20，微波时间7 min。为了验证试验的准确性，在此条件下进行3次平行试验，得到雷公藤甲素的得率的平均值为1.31×10-3%，与模型预测值接近，说明利用此模型可以确定雷公藤甲素微波萃取的最佳提取工艺条件。

3 结论

本文在单因素分析的基础上，用响应曲面法建立了以雷公藤甲素为响应值，以乙醇体积分数、料液比和微波时间为试验因子的回归模型，此模型拟合良好。经优化得到最佳萃取条件为：乙醇体积分数85%，料液比1∶20，微波时间7 min。本实验为提取雷公藤甲素提供了一种有效方法，为规模生产提供了有价值的工艺参数。