响应面法优化女贞子原花青素提取工艺及抗氧化研究

郗艳丽，周旋，霍明洋，高锐，马一芯，杨阔，徐斌，*

（1.吉林医药学院 公共卫生学院，吉林吉林132013；2.吉林医药学院 临床医学院，吉林吉林132013）

%女贞子原产于长江流域，主要在华南、河南、陕西、甘肃等地种植。后来被引入北方[1]。目前女贞子在气候适宜的地区均有种植，资源非常丰富。女贞子有滋补肝肾、养阴、止血的功效[2]。临床上常用于治疗肝肾阴虚、头晕、耳鸣、咽喉干燥、腰膝酸痛、月经过多[3-4]。女贞子表皮呈黑褐色或黑紫色，这些黑褐色或黑紫色物质中富含原花青素。原花青素是一类多酚化合物的统称，主要存在于植物的花、果实、种子及外皮中[5]，其中葡萄籽和松树皮中原花青素的含量极高[6]。原花青素在抗氧化方面具有无可比拟的优势，能有效清除机体内的自由基[7]，其清除自由基的能力是维生素E的50倍，Vc的20倍[8]，有明显的抗菌、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、保护血管、增强机体免疫力、增强机体抗辐射能力等功能[9-11]。

目前，从植物中分离原花青素的方法主要有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法、酶辅助提取法等[12]。传统的溶剂提取法虽能获得原花青素，但存在提取率较低、溶剂消耗量大、提取时间较长等不足之处。超声辅助提取法作为提取植物活性物质的新技术不仅具有操作简单、安全、节能、高效等优点，而且具有提取时间短、无需加热的特点，可有效减少原花青素等热敏物质在提取时的结构改变。近年来女贞子黄酮、多糖提取物抗氧化活性方面研究较多[13-14]，但女贞子原花青素抗氧化活性方面研究鲜见报道。因此，本研究以女贞子原花青素含量为评价指标，采用Box-Behnken设计-响应曲面法优化提取工艺，并分析女贞子原花青素对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，评价本研究方法提取的原花青素的生物活性，为女贞子的研究、开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

女贞子：吉林市某药房，产地为湖南；原花青素（生产批号：B21615）：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇：天津市永大化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：Sigma公司；维生素C（Vc）：上海生工有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BS224S电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；722型可见光分光光度计：上海菁华科技有限公司；KQ-800KDE高功率超声波清洗器：昆山舒美公司；EV311旋转蒸发仪：北京莱伯泰科公司。

1.3 女贞子原花青素的提取工艺流程

取女贞子药材适量，粉碎后过60目筛。称取女贞子粉末1.0 g，置于烧杯中，加入一定体积分数的乙醇溶剂超声辅助提取，冷却后5 000 r/min离心20 min，取上清，移入60 mL容量瓶中，用乙醇定容至60 mL，获得原花青素粗提液。

1.4 女贞子原花青素的含量测定

1.4.1 原花青素标准品溶液的制备

精密称取原花青素标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加适量50%乙醇超声（频率：50 kHz，功率：500 W）充分溶解，冷却后以50%乙醇补足至刻度，摇匀，得质量浓度为1.0 mg/mL的原花青素标准品溶液。

1.4.2 最大吸收峰的确定

精密吸取原花青素标准品溶液和样品提取液各1.0mL，以50%乙醇调零，用紫外分光光度计在200nm～600 nm波长范围内进行全波长扫描，记录扫描图谱并对比扫描图谱。

1.4.3 标准曲线的绘制

精密量取1.0 mg/mL的原花青素溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL，加入 50%乙醇至 1.0 mL，分别加入体积比为95∶5的正丁醇-盐酸溶液6.0 mL和2%硫酸高铁铵溶液0.2 mL，摇匀并定容至10 mL，沸水浴加热40 min，显色后立即使用冰水冷却，550 nm处比色测定，用同等体积的50%乙醇代替标准品作为空白对照，绘制原花青素的标准曲线，得回归方程为y=0.855 1x-0.001 5（x为原花青素标准品浓度，mg/mL；y为吸光度值），R2=0.999 2。

1.4.4 女贞子粗提液中原花青素提取率的计算

精确称取1.0 g女贞子粉末，按1.3方法进行提取，按照1.4.3的方法显色，用同等体积的50%乙醇代替标准品作为对照，将测定吸光度值带入标准曲线，求得粗提液样品中原花青素的质量浓度，代入下列公式求得女贞子中原花青素提取率。

式中：ρ为粗提液样品中原花青素的质量浓度，mg/mL；V为粗提液定容后的体积，mL；N为稀释倍数；m为女贞子的质量，g。

1.5 单因素试验设计

对女贞子中原花青素提取条件所涉及到的4个因素（液料比、提取时间、超声功率和乙醇体积分数）进行了考察，每个因素选取3个水平进行正交试验优化，得出最佳提取条件。1）液料比设定为 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）；2）提取时间设定为 10、20、30、40、50、60 min；3）超声功率设定为 320、400、480、540、640、720 W；4）乙醇体积分数设定为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。

1.6 响应面试验

在单因素试验的基础上，依据Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behenken试验设计原理，以女贞子提取液中原花青素提取率为响应值，以提取时间、超声功率、乙醇体积分数和液料比为因变量进行四因素三水平的响应面分析试验（见表1），优化超声波辅助提取女贞子原花青素工艺参数。

表1 响应面试验设计因素水平表Table 1 Design of factors and levels of response surface test

1.7 原花青素抗氧化试验

1.7.1 女贞子原花青素粗提物对DPPH自由基的清除作用

参照Vattem等[15]的方法并稍作修改。精密称取DPPH试剂4.5 mg，加无水乙醇溶解，棕色容量瓶定容至100 mL，浓度为0.08 mol/L，避光保存备用。分别取浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和 1.0 mg/L 的样品溶液1.0 mL，置于10 mL试管中，加入2.0 mL的DPPH溶液，30℃、避光反应40 min后，517 nm测定吸光度值，计算DPPH自由基的清除率，VC作为阳性对照。

式中：A1为1.0 mL样品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A2为1.0 mL样品溶液+2.0 mL蒸馏水的吸光度值；A3为1.0 mL蒸馏水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.7.2 女贞子原花青素粗提物对·OH的清除作用

参照尤小梅等[16]和张镜等[17]的方法并稍作修改，在比色管中依次加入浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L和1.0 mg/L的女贞子原花青素粗提物溶液，再加入1.0 mL 9 mmol/L的硫酸亚铁、1.0 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L的过氧化氢溶液。经37℃水浴反应0.5 h后，以蒸馏水作为参比，于510 nm下测定吸光度。按公式计算对·OH的清除率：

式中：A1为不加女贞子原花青素粗提物溶液的空白对照液的吸光度；A2为加入女贞子原花青素粗提物溶液后的吸光度；A3为无显色剂时提取剂本底吸光度。

1.7.3 女贞子原花青素粗提物对O2-·的清除作用

参照徐怀德等[18]的方法并稍作修改，女贞子原花青素粗提物对O2-·的清除作用采用邻苯三酚自氧化法进行测定，取 4.5 mL、pH 8.2、50 mmol/L 的 Tris-HCl缓冲液，4.2mL超纯水，混匀后25℃保温30min。加入25℃预热的3 mmol/L邻苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl配制）和1.0 mL超纯水，于325 nm下每隔30 s测定吸光度值，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。空白管用等体积蒸馏水代替样品溶液，用10 mmol/L的HCl代替邻苯三酚溶液。样品活性测定：在加入邻苯三酚前，分别加入为浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和 1.0 mg/L的原花青素粗提物溶液1.0 mL，然后按邻苯三酚自氧化法测定的方法操作，按公式计算清除率：

式中：A0为邻苯三酚自氧化速率吸光度值；A1为加入原花青素样品后的邻苯三酚自氧化速率吸光度值。

1.8 数据处理

采用Excel 2010软件作图，应用Design-Expert 8.0.6软件，分别对单因素试验数据和响应面数据进行分析处理，回执单因素变化趋势图、建立线性回归方程并判断模型显著性。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

原花青素在不同波长下的吸光度见图1。通过研究发现原花青素提取液与标准品溶液在550 nm处有共同最大吸收峰。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取时间对原花青素提取率的影响

图1 原花青素在不同波长下的吸光度Fig.1 Absorbance of proanthocyanidins at different wavelengths

提取时间对原花青素的提取率有很大影响。提取时间不足会造成提取不充分；提取时间太长，原花青素可能会降解，造成提取率下降，原花青素的生物活性也可能会因为提取时间太长而降低[19]。提取时间对原花青素提取率的影响见图2。

提取时间在30 min时，原花青素的提取率达到最大值，为（1.93±0.13）%。在提取时间为 10 min～20 min之间，提取率不高，可能与提取时间不足有关。提取时间不够，超声的作用没能发挥最大作用，当提取时间超过30 min以后，原花青素提取率略有下降，这可能与提取时间太长有关，提取时间太长，提取的原花青素发生降解而被破坏。所以提取时间暂定为30 min。

图2 提取时间对原花青素提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

2.2.2 超声功率对原花青素提取率的影响

超声的空化作用能使细胞碎裂，且超声具有搅拌和振荡作用，有利于液料的充分接触，促进胞内有效成分溶出[20]。但当超声功率增大到一定程度，会造成液体出现空化泡，减少能量传递，不利于原花青素的提取[21]。超声功率对原花青素提取率的影响见图3。

图3 超声功率对原花青素提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of proanthocyanidins

超声功率在350W～400 W范围内，原花青素提取率随超声波功率的增大而上升，在400 W处达到最大值，提取率为（2.82±0.42）%。当超声功率达到400 W以后，提取率呈下降趋势。故选择超声功率400 W为最佳提取条件。

2.2.3 液料比对原花青素提取率的影响

溶剂和原料在形成合适的比例时，有利于原花青素的溶出，提取率达到最高。溶剂与原料的比值增大，虽然有利于原花青素的浸出，但溶剂使用量过大，不仅会造成浪费，还会给超声作用带来阻力，不利于原花青素的提取。液料比对女贞子原花青素提取率的影响见图4。

图4 液料比对原花青素提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of proanthocyanidins

当液料比为30∶1（mL/g）时，女贞子原花青素提取率达到最大值，为（2.18±0.19）%。当液料比从30∶1（mL/g）增加到 60 ∶1（mL/g），原花青素提取率略有降低。从节能环保角度出发，选择30∶1（mL/g）为最佳液料比。

2.2.4 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响

乙醇体积分数对原花青素提取率的影响见图5。

图5 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响Fig.5 Effect of f ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

图5结果显示，随着乙醇浓度不断增大，原花青素提取率持续增加，可能与乙醇能促进氢键断裂有关。乙醇作用后能形成小分子的原花青素，从而使溶液中的原花青素提取率升高。当乙醇浓度为40%时，原花青素提取率最高，达到（2.50±0.39）%。当乙醇浓度高于40%，原花青素提取率逐渐下降，这可能与原花青素的极性较强有关，乙醇浓度太高会造成溶液极性弱，水溶性原花青素析出反而会减少有关。故选定40%的乙醇体积分数为最佳提取条件。

2.3 响应面试验

2.3.1 模型方程建立与显著性检验

Box-Behnken试验设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

通过Design Expert 8.0.6软件进行多元回归分析，得到回归方程为Y=2.786+0.076A-0.066B+0.478C+0.068D+0.138AB-0.348AC+0.198AD-0.573BC-0.083BD-0.248CD-0.586A2-0.303B2-0.638C2-0.021D2。方差分析表见表3。

由表3可知，女贞子原花青素提取模型的P<0.05，表明该回归模型是有效可靠的，达到了极显著水平（P<0.001），用该模型对女贞子原花青素的提取工艺进行试验分析是合理的。该模型失拟项的P值为0.407 5>0.05，不显著，对模型有利。相关系数R2=0.8898，该模型能解释88.98%响应值的变化，校正系数R2Adj=0.779 6，变异系数值为11.54，说明该模型的可行度较好，可以用来分析女贞子原花青素的提取率。根据表3中F值的大小，推测影响本次试验提取率大小的因素为提取时间（A）>乙醇体积分数（D）>超声功率（B）>液料比（C）。从表3中可以看出，二次项BC、A2、B2和C2对响应值的影响极显著（P<0.01）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

2.3.2 响应面分析

图6为影响女贞子原花青素提取率的各因素交互作用的响应面图。从响应面分析图可看出最佳参数及各参数之间的相互作用。

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，马鞍形或者椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则表示不显著。由图6知，响应面顺着提取时间的方向陂度最大，结合方差分析，可以得到提取温度在交互作用中对女贞子原花青素提取率的影响最显著，乙醇体积分数与超声功率的影响次之，液料比的影响作用不显著。

由Design-Expert 8.06软件分析得出：在稳定状态下女贞子原花青素的提取率最大值为2.90%，此时的提取条件为提取时间33.32 min，超声功率408.48 W，液料比27.03∶1（mL/g），乙醇浓度50%。理论预测女贞子原花青素的提取率为2.90%。以实际操作的方便考虑，将提取条件修正为提取时间33 min，超声功率400 W，液料比 27∶1（mL/g），乙醇浓度 50%。

图6 各自变量间交互作用对女贞子原花青素提取率的响应面图Fig.6 Response surface diagram of independent variable interaction effect to extraction yield of proanthocyanidins from Ligustrum lucidum ait

2.4 验证试验

根据优化的提取工艺，进行3次验证试验，结果女贞子原花青素的提取率分别为2.91%、2.79%和2.85%，女贞子原花青素提取率的平均值为（2.85±0.06）%，相对标准偏差为0.28%，与预测相对误差为0.18%，表明该优化方案稳定可靠，具有实用价值。

2.5 原花青素抗氧化试验

2.5.1 女贞子原花青素粗提物对DPPH自由基的清除作用

女贞子原花青素粗提物对DPPH自由基的清除作用见图7。

图7 女贞子原花青素粗提物对DPPH自由基的清除作用Fig.7 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on DPPH radical

由图7可知，女贞子原花青素提取物对DPPH自由基有较好的清除作用。随着女贞子原花青素提取物浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率逐渐升高。女贞子原花青素提取物的浓度与DPPH自由基的清除率呈依赖性。女贞子原花青素提取物对DPPH自由基的清除效果显著高于阳性对照物VC。

图8 女贞子原花青素粗提物对·OH自由基的清除作用Fig.8 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on hydroxyl radical

2.5.2 女贞子原花青素粗提物对·OH的清除作用

女贞子原花青素粗提物对·OH的清除作用见图8。

由图8可知，女贞子原花青素提取物对·OH有较好的清除作用。女贞子原花青素提取物的浓度与·OH的清除率呈依赖关系。女贞子原花青素对·OH的清除效果显著高于阳性对照VC。当女贞子原花青素提取物和VC的浓度增从0.6 mg/mL增加到1.2 mg/mL时，此时其对·OH的清除率已接近饱和状态，因而自由基的清除率变化不显著。

2.5.3 女贞子原花青素粗提物对O2-·自由基的清除作用

女贞子原花青素粗提物对O2-·自由基的清除作用见图9。

由图9可知，女贞子原花青素提取物对O2-·有较好的清除作用。女贞子原花青素提取物的浓度与O2-·的清除率呈依赖关系。女贞子原花青素对O2-·的清除效果显著高于阳性对照VC。

图9 女贞子原花青素粗提物对O2-·自由基的清除作用Fig.9 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on superoxide anion radical

3 结论

本研究利用响应面分析法对女贞子原花青素的超声提取工艺进行优化。首先通过单因素试验，观察了提取时间、超声功率、液料比和乙醇体积分数4个因素对女贞子原花青素提取率的影响。在此基础上，采用三因素四水平的响应面分析法进行试验，优化得出女贞子原花青素最佳的提取工艺是提取时间33 min，超声功率400 W，液料比27∶1（mL/g），乙醇浓度 50%。经方差分析显示模型拟合度较高。通过验证性试验证实在最优条件下原花青素的提取率达2.85%，与预测值2.90%十分接近。由此可见，该模型能有效指导女贞子原花青素提取工艺条件的优化，通过响应面分析法优化女贞子原花青素提取工艺在实践上是可行的。此外，本研究结果还表明，当原花青素浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达到97%；对O2-·的清除率可达到60.14%；对·OH的清除率可达到78.88%。女贞子原花青素提取物具有良好的体外抗氧化活性。