猪胰脏中胰脂肪酶的提取及其稳定性研究

龙娇妍，王娟，岳晓禹

（河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南郑州450046）

胰脂肪酶的应用范围比较宽泛，如食品、化妆品、皮革、医药、洗涤剂等相关领域，尤其在油脂化工及有机合成工业中。胰酶包括胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶[1]，而动物胰腺中胰淀粉酶、胰脂肪酶、核糖核酸酶为活性酶[2]。目前国内外制得的脂肪酶主要来自于微生物，很少以动物为原材料生产脂肪酶[3]。

胰脂肪酶可以将骨粉中残留的脂质水解为脂肪酸，从而有利于人体对骨钙的吸收[4]。医用胰酶制剂能够很好地与胃酸结合并提高其酶活力，改善其消化功能，有助于用来治疗消化性溃疡和小儿腹泻[5]。

国内外把胰脂肪酶作为单独研究对象的文献屈指可数，大多数是对胰蛋白酶的研究，或是同时研究3种酶的制备工艺，制备的是含有胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的混合物[6]。目前胰酶的提取方法有很多种，例如有机溶剂（丙酮、乙醇、异丙醇等）提取法、盐溶液提取法、水洗提取法等，其中有机溶剂提取法，需要使用大量的有机溶剂，不仅会增加生产成本，而且会造成严重污染环境，甚至会存在爆炸和引发火灾等安全隐患[7]。相对有机溶剂提取法而言，壳聚糖絮凝沉淀法[8-9]具有用量少、无毒无害、使用安全、对环境无污染等优点，但是使用此种方法制备的胰酶酶活力比较低。

万峰[3]、吴晓英[10]、魏文毅等[11]使用有机溶液进行提取，余武英等[12]用聚乙二醇沉淀猪胰蛋白酶，唐爱星[8]、张廷红等[9]用壳聚糖絮凝法获得产品酶、许浩鸿等[13]通过胰脏自溶水提取制备胰酶、郭兆斌等[14]通过单因素试验和正交试验得出胰酶制备的最佳工艺条件。

液体酶制剂稳定性比较差，很多研究者对液体酶稳定性进行探究，如蒋安生[15]、曹磊等[16]均对液体酶的保存进行研究，在液体酶中加入稳定剂可以提高其保存稳定性。白净等[17]论述了酶制剂浓缩方法的研究进展。

本研究以冷冻猪胰脏为原材料，通过单因素试验与正交试验得出胰脂肪酶最佳提取条件，同时用透析对其进行浓缩，并探究复合稳定剂以及保存温度对液体酶稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要试剂

冷冻猪胰脏：河南省郑州市双汇食品有限公司。

橄榄油：罗恩试剂；聚乙烯醇（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠、磷酸氢二钠、丙三醇、吐温80、酚酞（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

汉佳欧斯PY-790绞肉机、IKA T25高速分散均质机、IS120-3C型pH计：上海仪迈仪器科技有限公司；DNP-9272电热恒温培养箱：上海三发科学仪器有限公司；H·S-420BS电热恒温水浴锅：上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX-250L-B-1生化培养箱：上海福玛实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验流程及操作要点

将解冻后的猪胰脏进行前处理，除去结缔组织与脂肪后用绞肉机将其绞碎制得胰浆，准确称量5 g或10 g后加入提取液进行提取以及其他相关操作。胰脂肪酶提取工艺参考Hans Schultze[17]、吴晓英等[7]的方法，并做出一定的改变。

1.2.1.1 试验流程

冷冻猪胰脏→解冻→去脂肪→制胰浆→称量→提取→过滤→梯度稀释→酶活测定

1.2.1.2 操作要点

1）提取：向称量过的胰浆中加入提取剂（体积为胰浆的2倍），放在某一温度下搅拌提取若干小时。

2）过滤：将提取后的胰脂肪酶酶液用双层纱布进行过滤。

3）稀释：用蒸馏水作为稀释液，稀释时应控制酶液的浓度，使样品与空白间的碱量消耗之差控制在1 mL至2 mL范围内。

4）酶活测定：使用指示剂滴定法进行测定，酶活测定中所使用的溶液按照GB/T 601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》配制，底物溶液注意要现配现用。脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示，1 mL液体酶（或1 g固体酶粉），在一定温度和pH值条件下，1 min水解底物产生1 mol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以 U/mL（U/g）表示。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 提取剂的种类

将一定量冷冻猪胰脏绞碎成胰浆，准确称取3份10 g胰浆，分别以2倍体积加入蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液、0.15 mol/L氯化钠溶液进行提取，提取温度为25℃，提取时间为2 h。将提取后的酶液用双层纱布进行过滤，吸取1 mL过滤后的酶液进行稀释，随即进行酶活力的测定。

1.2.2.2 提取时间

由前期试验得出较优提取剂为磷酸盐缓冲溶液，因此确定磷酸盐缓冲溶液作为提取剂，探究时间对提取过程中胰脂肪酶酶活力的影响。将提取时间定为1、2、3、4、5、6 h 6个梯度，提取温度为室温（25 ℃），进行酶活力的测定。

1.2.2.3 提取温度

以磷酸盐缓冲溶液作为胰脂肪酶的提取剂，将提取温度定为 4、15、25、35、45 ℃ 5 个梯度，提取时间为2 h，进行酶活力的测定。

1.2.2.4 提取pH值

以磷酸盐缓冲溶液作为胰脂肪酶的提取剂，将提取 pH 值定为 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 五个梯度，提取时间为2 h，进行酶活力的测定。

1.2.2.5 复合稳定剂

本试验所使用的稳定剂有阿拉伯树胶、山梨醇、丙三醇、氯化钠、可溶性淀粉、麦芽糖、吐温80、葡萄糖酸钙。将以上单个稳定剂进行组合，得到2个复合稳定剂，分别为复合稳定剂1与复合稳定剂2，其中复合稳定剂1为1.2%阿拉伯树胶、1.2%山梨醇、1.0%丙三醇、1.2%氯化钠，复合稳定剂2为1.0%丙三醇、1.2%氯化钠、2.2%葡萄糖酸钙、1.2%麦芽糖、1.2%可溶性淀粉。当液体酶的存放时间较长时，容易散发出异味，加入丙三醇可以在一定程度上减少这种现象的发生。将经过磷酸盐缓冲溶液提取后的胰脂肪酶酶液分成两等份，取一份加入复合稳定剂1，另一份加入复合稳定剂2，随即将两者放在同样的条件下进行保存。经提取的酶液要进行酶活测定，记为原始酶活，追踪8 d内胰脂肪酶的保存率，以天为单位记录胰脂肪酶的酶活力并以百分比的形式表示酶的保存率。

1.2.2.6 保存温度

由试验结果得出较优胰脂肪酶液保存的复合稳定剂，并使用此复合稳定剂来探究保存温度对胰脂肪酶稳定性的影响。将保存温度定为25、30、35℃3个梯度，其他条件均相同，以天为单位测量8 d内各个温度下胰脂肪酶的酶活力并以百分比的形式表示液体酶的保存率。

1.2.2.7 透析试验

液体酶中含有的其他物质比较多，可能存在影响胰脂肪酶酶活力的物质，因此使用透析袋（20 000 D）进行透析处理。将装有10 mL酶液的透析袋浸没在用蒸馏水制成的聚乙二醇-20 000溶液中，将其放在4℃条件下进行透析，透析2 h～3 h内换一次透析液，然后在5 h～6 h内换一次透析液，接着过夜透析，透析总时间为24 h，最后测定并分析透析对胰脂肪酶酶活力的影响。注意透析液的使用量务必保证能够浸没透析袋。

1.2.3 正交试验

根据前期的试验结果，对提取剂、提取温度、提取时间、提取pH值4个因素设定3个水平，使用正交表L9（34）进行优化试验，从而可以选出最优水平组合，胰脂肪酶提取正交试验因素水平设定见表1。

表1 胰脂肪酶提取正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for extraction of pancreatic lipase

1.2.4 胰脂肪酶酶活力的测定

按照GB/T 23535-2009《脂肪酶制剂》中的指示剂滴定法进行酶活力测定与计算。

1.3 数据处理

本文中每组试验平行测定3次，数据表示为平均数±标准差，用SPSS 24.0版本软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取剂

虽然酶的提取剂种类很多，但是有机溶剂的大量使用对生活环境有一定程度的影响，并且会增加提取成本。本试验在探究过程中使用的提取剂为磷酸盐缓冲溶液（pH 7.5）、0.15 mol/L氯化钠溶液、蒸馏水，这类提取剂的成本相对比较低廉，有利于提升生产者的经济效益。通过探究3种提取剂对胰脂肪酶酶活力的影响，得出的试验结果如表2所示。

由表2可知，3种提取剂对胰脂肪酶酶活力有不同程度的影响（P＜0.05），其中以磷酸盐缓冲溶液（pH 7.5）为提取剂得到的脂肪酶酶活力比较高，因此可以确定其为最佳提取剂。

表2 提取剂对胰脂肪酶酶活力的影响Table 2 Effect of extractant on activity of pancreatic lipase

2.1.2 提取时间

不同种类酶的提取时间有一定的差异，同时对于同一种酶而言，使用不同的提取剂其最佳的提取时间也不尽相同。通过探究提取剂对胰脂肪酶酶活力的影响，得出相对最佳提取剂为磷酸盐缓冲溶液（pH 7.5）。后续试验均以磷酸盐缓冲溶液为提取剂进行探究，通过探究时间对胰脂肪酶酶活力的影响，得出的试验结果如表3所示。

表3 时间对胰脂肪酶酶活力的影响Table 3 Effect of time on activity of pancreatic lipase

由表3可知，提取时间为1 h～2 h时，胰脂肪酶酶活力呈上升趋势（P＜0.05），当提取时间为 2 h～6 h 时，胰脂肪酶酶活力呈下降趋势，在3 h～4 h时胰脂肪酶酶活力下降更加明显。综上可以得出结论，以磷酸盐缓冲溶液（pH 7.5）为胰脂肪酶的提取剂时，其较优提取时间为2 h。提取时间过短就会造成提取不完全，提取时间过长会导致部分酶失活，所以适当的提取时间有利于保持较高酶活力。

2.1.3 提取温度

温度是酶活力的影响因素之一，温度过低会使酶活力降低，温度过高会使酶变性失活，因此提取温度是提取酶时需要注意的方面之一。以磷酸盐缓冲溶液（pH 7.5）为提取剂，提取时间为2 h，探究提取温度对胰脂肪酶酶活力的影响，结果如表4所示。

由表4可以得出，随着温度的升高，胰脂肪酶酶活力呈下降趋势，当提取温度为4℃和15℃时，胰脂肪酶酶活力差异较为显著。综上所述，以磷酸盐缓冲溶液（pH 7.5）为提取剂，提取时间为2 h时，可以确定其较优提取温度为4℃。

表4 温度对胰脂肪酶酶活力的影响Table 4 Effect of temperature on activity of pancreatic lipase

2.1.4 提取pH值

过酸过碱都会使酶丧失活性，适宜的提取pH值会使酶的提取得到比较理想的效果。以磷酸盐缓冲溶液为提取剂，探究pH值对胰脂肪酶酶活力的影响，结果如表5所示。

表5 pH值对胰脂肪酶酶活力的影响Table 5 Effect of pH on activity of pancreatic lipase

由表5可以得出，在25℃条件下，以磷酸盐缓冲溶液为提取剂，提取时间为2 h时，当pH值为6.5～7.5时，胰脂肪酶酶活力呈上升趋势，其中pH值为6.5～7.0时，pH值对胰脂肪酶酶活力影响较为显著（P＜0.05）；当pH值为7.5～8.5时，胰脂肪酶酶活力呈下降趋势，其中pH值为7.5～8.0时，pH值对胰脂肪酶酶活力影响较为显著（P＜0.05）。综上所述，在25℃条件下，以磷酸盐缓冲溶液为提取剂，提取时间为2 h时，其适宜提取pH值为7.50。

2.1.5 复合稳定剂

不同的复合稳定剂配方对胰脂肪酶的保存率的影响程度不同，通过探究复合稳定剂1与复合稳定剂2对胰脂肪酶的保存率的影响，得出的试验结果如表6所示。

由表6可知复合稳定剂1与复合稳定剂2均可以使胰脂肪酶酶液至少保存1周，其中复合稳定剂2的保存效果比较理想，保存时间也比较长，为两种复合稳定剂中较优配方。当加入复合稳定剂的液体酶保存至第8天时，使用复合稳定剂1中的胰脂肪酶保存率为（89.37±0.96）%，使用复合稳定剂2中的胰脂肪酶保存率为（135.86±4.50）%，由此可以确定复合稳定剂2的配方对液体酶的保存有良好的效果。

表6 复合稳定剂对胰脂肪酶保存率的影响Table 6 Effect of compound stabilizer on the retention rate of pancreatic lipase

2.1.6 保存温度

温度会影响酶的稳定性，因此使用复合稳定剂2来探究胰脂肪酶的适宜存放温度。将复合稳定剂加入经提取的胰脂肪酶液中，分别放在不同的温度下存放一定时间，及时取出并测定胰脂肪酶酶活力，并通过比较其相应酶活力的大小，说明不同保存温度对胰脂肪酶稳定性的影响。本试验取25、30、35℃作为酶的存放温度，结果如表7所示。

表7 保存温度对胰脂肪酶稳定性的影响Table 7 Effect of preservation temperature on stability of pancreatic lipase

由表7可以得出，在没有使用复合稳定剂的情况下，胰脂肪酶酶活力呈直线型下降，且在第6天时胰脂肪酶酶活力已经完全失活。在25℃与30℃下，胰脂肪酶的保存趋势基本一致，但在25℃下胰脂肪酶的保存率较好，在35℃下胰脂肪酶保存率较差，第8天时已经下降至（41.60±6.58）%，因此25℃是较为适宜的胰脂肪酶液存放温度。

2.1.7 透析

透析袋透析法是酶浓缩的一种方法，通过探究反渗透透析对胰脂肪酶酶活力的影响，得出的试验结果如表8所示。

表8 透析对胰脂肪酶酶活力的影响Table 8 Effect of dialysis on activity of pancreatic lipase

用磷酸盐缓冲溶液提取后的胰脂肪酶液经过24 h的透析可以得到少量固体，经过准确称量、梯度稀释后测得的胰脂肪酶酶活力相对比较高，因此可通过透析袋透析法制得酶活力比较高的酶制剂。

2.2 正交试验

正交试验结果见表9，正交试验方差分析见表10。

表9 正交试验结果Table 9 Results of orthogonal test

由表9可以得出影响胰脂肪酶提取的因素主次顺序为pH值>提取剂>温度>时间，最优组合为A1B1C2D2，即当提取剂为0.15 mol/L氯化钠溶液，提取温度为25℃，提取时间为1 h，提取pH值为7.5时，得到的胰脂肪酶液的酶活力相对比较高。由于正交试验中没有A1B1C2D2组试验，因此以最优提取条件进行验证，得到胰脂肪酶酶活力782.65 U/mL。由表10的方差分析结果可知，提取温度、提取pH值、提取剂3个因素对胰脂肪酶的酶活力都具有极显著的影响，提取时间对试验结果有显著影响，与极差分析的结果一致。

表10 正交试验方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiment

3 结论

通过探究影响猪胰脏中胰脂肪酶提取的因素，最终确定较优方案为以0.15 mol/L氯化钠溶液为提取剂，提取时间为2 h，提取pH 7.5，提取温度为25℃，在此条件下提取得到的胰脂肪酶酶活力为782.65 U/mL。将复合稳定剂2（1.0%丙三醇、1.0%吐温80、1.2%氯化钠、2.2%葡萄糖酸钙、1.2%麦芽糖、1.2%可溶性淀粉）添加到提取后的胰脂肪酶酶液中，可使酶液的保存时间至少延长至1周。当使用复合稳定剂2作为稳定剂配方时，其适宜保存温度为25℃。本试验探究得出的提取工艺具有提取周期短、提取成本低廉、提取方法简便、提取条件容易满足、安全性比较高等特点，具有一定的实践价值。