基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法的建立

张玉超，刘旭东

（1.茅台学院酿酒工程系，贵州仁怀564507；2.茅台学院食品科学与工程系，贵州仁怀564507）

作为生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料，双酚A（bisphenol A，BPA）的使用量逐年升高[1-2]。随着这些材料的广泛使用，特别是在食品行业中的使用，BPA迁移后可通过生物链进入生物体。作为一种典型的环境内分泌干扰物，BPA可通过干扰内分泌功能对生物体产生生殖发育毒性、神经毒性、致癌性等多种毒性作用[3-5]。因此，BPA残留量的检测对于控制BPA的环境暴露量，保护人类健康和生态环境有重要意义。

目前国内外对于BPA的检测基本采用仪器分析法，这些检测方法依赖价格昂贵的检测设备，例如高效液相色谱仪、气相色谱仪、质谱仪等，操作和样品前处理复杂，且不能同时对大量样品进行检测[6-7]。酶联免疫分析法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）依赖高特异性的抗体，利用抗原-抗体特异性反应，很好地弥补了仪器分析法的不足[8-9]。本研究以制备BPA单克隆抗体为基础，构建一种BPA的间接竞争ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）检测方法，为 BPA ELISA检测技术发展提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠：湖北省疾病预防控制中心实验动物中心；Sp2/0细胞：武汉大学保藏中心。

BPA、双酚酸（4，4-bis（4-hydroxyphenyl）valeric acid，BVA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDAC）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：国药集团药业股份有限公司；福氏完全佐剂（Freund′s complete adjuvant，FCA）、福氏不完全佐剂（Freund′s incomplete adjuvant，FICA）：Sigma-Aldrich公司。以上试剂均为分析纯。

包被缓冲液：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，pH7.4）；抗体稀释液：含0.1%BSA的PBS；封闭液：3%脱脂奶粉溶液；洗涤液：含0.05%吐温-20 的 PBS；终止液：2 mol/L H2SO4。

DMEM培养基、HAT培养基、HT培养基：Thermo公司。

1.2 仪器与设备

S-3100型紫外分光光度计：Scinco公司；ELX800型酶标仪：Bio-tek公司；5415R型低温冷冻离心机：Eppendorf公司；BB15型CO2恒温细胞培养箱：Thermo公司；TS2-FL型倒置显微镜：Nikon公司。

1.3 BPA人工抗原合成

以BVA作为半抗原与BSA、OVA分别进行偶联，制备完全抗原BVA-BSA、BVA-OVA。在文献的基础上进行改进[10]，取 0.9 mg BVA、2.98 mg NHS、4.56 mg EDAC溶于 300 μL DMF 中，17 ℃，130 r/min，避光反应 16 h，得到溶液A。将12 mg BSA和12 mg OVA分别溶于2 mL pH9的PBS中，得到溶液B。将溶液A逐滴加入溶液B中，搅拌均匀后25℃左右下避光反应12 h，得到溶液C。将溶液C在6 000 r/min离心5 min，取上清液装入透析袋置于pH7.4，0.01mol/L的PBS中，4℃透析至少48 h，每隔12 h换液1次。对所得的人工抗原进行紫外扫描确定偶联是否成功，-20℃保存备用。

1.4 免疫BALB/c小鼠

对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点人工抗原免疫（BVA-BSA 或 BVA-OVA 100 μg溶解于 100 μL pH7.4的PBS中，与等体积的FCA或FICA混合），按表1的免疫方案进行免疫[11]。

表1 免疫方案Table 1 The immunization protocol

1.5 抗血清效价和灵敏度的测定

第4次免疫7 d后，对免疫的小鼠进行断尾取血，对抗血清的效价和灵敏度分别采用间接ELISA（indi rect noncompetitive ELISA，inELISA）和间接竞争ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）进行测定[12]。免疫原为BVA-OVA的小鼠抗血清进行ELISA测定时使用1.0 mg/mL BVA-BSA作为包被原，免疫原为BVABSA的小鼠抗血清使用1.0 mg/mL BVA-OVA作为包被原。选择抗血清效价和灵敏度都很高的小鼠作为细胞融合中脾细胞的供体。

1.6 单克隆抗体的制备和纯化

在细胞融合前3 d，对小鼠进行200 μg免疫原腹腔注射（加强免疫），取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下进行细胞融合，在HAT培养基中培养，记录有融合细胞的孔，待细胞克隆长至板底约1/10时，用icELISA对细胞培养上清液进行检测，选取特异性最好的阳性细胞孔进行有限稀释。将HAT培养基换成HT培养基，阳性细胞至少进行3次克隆化，使得阳性率达到100%后换DMEM培养基扩大培养建立细胞株。取10周龄BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡，10 d后腹腔注射状态良好的杂交瘤细胞株（1×106个～2×106个），10 d后无菌操作收集小鼠腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化[12]。

1.7 包被抗原浓度和抗体稀释比的确定

将包被原稀释至 1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，4 ℃包被过夜，将BPA单克隆抗体按照1∶8 000、1∶16 000、1 ∶32 000、1 ∶64 000、1 ∶128 000、1 ∶256 000、1 ∶512 000的体积比进行倍比稀释，进行方阵滴定[13]。选取OD450值大约为1的组合进行icELISA测定，选择IC50值最小的组合作为最佳包被抗原浓度和抗体稀释比组合。

1.8 间接竞争ELISA法条件优化

在最佳包被抗原浓度和抗体稀释比下对反应体系中有机溶剂的种类及含量、pH值、温度、封闭剂进行优化。分别使用5%、10%、15%、20%、25%的DMSO、DMF、甲醇、乙腈配制BPA标准溶液，进行icELISA，计算各反应条件下的IC50，选取IC50值最小的条件进行后续条件的优化。采用同样的方法对竞争反应体系pH值（6.4、7.4、8.4、9.4）、反应温度（4、25、30、37 ℃）、封闭剂（1%BSA、1%OVA、1%明胶、3%脱脂奶粉）进行优化，选择IC50最小的条件作为BPA检测icELISA法的最优条件。

1.9 BPA检测间接竞争ELISA法标准曲线的建立

根据所建立的icELISA检测方法，采用不同浓度的 BPA 标准溶液（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200 ng/mL）与BPA单克隆抗体竞争，以抑制率为纵坐标，Lg（10×CBPA）为横坐标绘制标准曲线，并计算IC50。

1.10 交叉反应率的测定

采用1.9所述方法，将BPA标准液换成BPA类似物双酚S、BVA、对苯二酚、邻羟基苯甲酸标准品，进行IC50的测定，计算交叉反应率CR，CR/%=BPA的IC50/BPA 类似物 IC50×100。

1.11 加标回收率的测定

利用去离子水将BPA配制成浓度为2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的加标水样，采用icELISA法测定水样中BPA含量，计算加标回收率/%=实际测得的BPA浓度/BPA标准浓度×100。

1.12 数据处理

试验数据用SPSS 13.0进行分析，以平均值±标准差形式呈现；以GraphPad Prism 5.0进行制图。

2 结果与分析

2.1 BPA人工抗原的合成

BVA与BSA和OVA通过活性酯法偶联后，BVA、BSA、OVA、BVA-OVA和BVA-BSA的紫外扫描结果如图1、2所示。

图1 BVA、OVA、BVA-OVA紫外扫描图Fig.1 Ultraviolet absorbance spectra of BVA，OVA，BVA-OVA

图2 BVA、BSA、BVA-BSA紫外扫描图Fig.2 Ultraviolet absorbance spectra of BVA，BSA，BVA-BSA

结果显示BVA在220 nm～290 nm范围内有强吸收峰，在275nm处出现了最高吸收峰；OVA在215nm和270 nm处有最强吸收峰；BVA-OVA在220 nm～300 nm范围内有强吸收峰，在290 nm附近有最强吸收峰，BVA-OVA体现了BVA和OVA的吸收特征，且最大吸收峰波长出现了一定的红移，又显示出自身的特性，因此可以判断BVA和OVA偶联成功。BVA和BSA偶联情况和上述类似，可以判断BVA和BSA偶联成功。

2.2 抗血清效价和灵敏度的测定

免疫周期完成以后，对各免疫小鼠抗血清的效价和灵敏度进行测定，结果如表2所示。

结果显示，BVA-BSA作为免疫原显示出了比较高的灵敏度（IC50低），但是总体效价偏低，而BVA-OVA作为免疫原，特别2号小鼠产生的抗血清具有高效价（>256 000）和高灵敏度（IC50＜221 ng/mL）。所以2号小鼠选择作为脾细胞供体制备杂交瘤细胞。

表2 抗血清效价和灵敏度Table 2 Titers and sensitivity of antisera

2.3 杂交瘤细胞的筛选

杂交瘤细胞的筛选结果见表3。

经细胞融合，筛选到6株阳性细胞株，其中3A11细胞株随BPA竞争浓度的增加OD450显色程度下降明显，说明其可分泌对BPA亲和力较高的单克隆抗体。此细胞株被选择用于采集腹水，收集到的腹水采用辛酸-硫酸铵法纯化。

表3 杂交瘤细胞的筛选Table 3 Screening of hybridoma cells

2.4 icELISA法的建立

方阵滴定的结果显示，在包被抗原的质量浓度和抗体稀释倍数为 1 μg/mL、256 000，0.5 μg/mL、128 000，0.25 μg/mL、64 000，0.25 μg/mL、32 000，0.125 μg/mL、32 000时OD450值大约为1。对以上几种组合的灵敏度进行测定，结果见表4。

表4 最适包被抗原质量浓度和单克隆抗体稀释倍数组合的IC50值Table 4 IC50for screening of optimal coating concentration and diluted multiples of monoclonal antibody

表4的结果显示，包被抗原的质量浓度为1μg/mL，抗体稀释倍数为256 000时IC50最低，且抗体稀释度最大，因此选择此组合作为最适包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数组合。

竞争反应体系中有机溶剂的种类和浓度、竞争反应体系pH值、竞争反应体系温度以及封闭剂的种类对icELISA的影响如图3～6所示。

图3 有机溶剂对icELISA的影响Fig.3 Influence of organic solvents on icELISA

图4 pH值对icELISA的影响Fig.4 Influence of pH on icELISA

图5 反应温度对icELISA的影响Fig.5 Influence of temperature on icELISA

图6 封闭剂对icELISA的影响Fig.6 Influence of blocking agents on icELISA

结果显示，反应体系中添加15%的DMSO，体系pH值为7.4，温度为25℃，并采用1%OVA作为封闭剂icELISA的灵敏度最高。因此优化的icELISA反应条件为：以1 μg/mL的BVA-BSA为包被抗原，BPA单克隆抗体稀释倍数为256 000倍，竞争反应体系添加15%的DMSO，pH7.4，25℃，以1%OVA作为封闭剂。

2.5 BPA icELISA检测标准曲线的构建

按照icELISA的检测条件，利用BPA不同浓度的标准品构建的检测标准曲线见图7。

图7 BPA icELISA检测标准曲线Fig.7 Standard curves of BPA by icELISA

标准曲线在0.5 ng/mL～50 ng/mL范围内显示出了良好的线性关系，IC50值为16.65 ng/mL，检测下限IC10为0.5 ng/mL。

2.6 交叉反应率测定

利用本研究所得的单克隆抗体与BVA、双酚S、对苯二酚和邻羟基苯甲酸进行icELISA，计算IC50，结果如表5所示。结果显示4种BPA类似物的交叉反应率均非常小，说明本研究所得到的BPA单克隆抗体特异性好。

表5 交叉反应率Table 5 Cross-reactivity of the assay

2.7 水样中加标回收率测定

水样中加标回收率的结果如表6所示，结果显示BPA的加标回收率为89.72%～105.25%。

表6 水样中BPA加标回收率Table 6 Recovery rate of BPA in water

3 结论与讨论

BPA在人类生活中有着广泛的应用，由于可以迁移到食品和周围环境中，且具有多种毒性，特别是内分泌干扰作用，对人和动物的健康具有严重危害。目前BPA仪器分析法存在很多的不足，而ELISA检测法很好地弥补了仪器分析法的不足。

由于BPA属于小分子化合物，只具有反应原性无免疫原性，所以需要合成大分子的人工抗原进行免疫。本研究选用BPA结构类似物BVA作为半抗原，引入了3个直链碳原子连接臂和羧基，通过碳化二亚胺法将BVA与BSA、OVA偶联，合成人工抗原BVABSA和BVA-OVA。以往的研究认为BSA由于具有很多优点，是制备人工抗原的首选蛋白载体[14]。而在本研究中，BVA-BSA免疫的所有小鼠抗血清对于BPA有着较好的特异性，但是效价很低；而BVA-OVA免疫的小鼠中则出现了特异性和效价都很高的个体，而在后期的icELISA方法构建中，选择BVA-BSA作为包被原体现出了很好的灵敏度。说明选择以何种蛋白质作为载体蛋白需要通过最终的免疫效果来确定。

传统的制备抗体的免疫方案是在第一次免疫时将抗原与等体积的FCA混匀注射，随后每2～4周换用抗原与等体积的FICA混匀注射进行加强免疫[15-16]，此种方法获得高效价的抗体周期长，一般需要3个月左右。本研究依据前期研究，在第3天重复第1次免疫，在第28天换用FICA进行免疫，在第49天再进行加强免疫，采用4次免疫筛选出血清效价和特异性较高的小鼠，缩短了免疫周期。并采用聚乙二醇法进行细胞融合，经过3次筛选，成功获得一株分泌抗BPA单克隆抗体的细胞株。

ELISA反应受多种因素影响，在建立ELISA检测方法前需要对反应体系的包被抗原浓度和抗体工作浓度、有机溶剂种类和含量、反应温度、pH值、封闭剂种类等条件进行优化[17-20]，从而提高检测的灵敏度。本研究中以IC50作为不同条件下icELISA的判断标准，确立了基于BPA单克隆抗体的icELISA方法，该检测方法检测下限IC10为0.5 ng/mL，IC50值为16.65 ng/mL，水样中加标回收率为89.72%～105.25%。

本研究构建了基于BPA单克隆抗体的icELISA检测方法，该方法与传统的仪器分析法相比具有快速、简便、灵敏等优点，可用于BPA残留量的检测，具有良好的应用前景。