生物解离大豆蛋白及肽的研究进展

吴隆坤，江连洲，范志军，王东梅，罗义

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034；3．黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，黑龙江佳木斯154007）

生物解离技术加工大豆是在挤压膨化等预处理基础上，应用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等破坏大豆细胞壁，水解蛋白与油脂的脂蛋白复合体释放油脂，并利用油水比重、蛋白质对油和水的亲和力差异，将油脂、蛋白质及其他成分进行分离，经破乳工艺制取油脂的绿色加工技术[1]。生物解离大豆工艺反应条件温和，操作简单、效率高、能耗低、毛油质量高、色泽浅，实现油脂与蛋白的同步提取，且油脂和蛋白的性质基本无变化，是一种新型的绿色油脂、蛋白加工工艺。大豆蛋白是生物解离制取大豆油脂的主要副产物，本文对生物解离大豆蛋白、肽的研究进行综述，对其生产制取和生物功能特性进行了阐述，为工业生产、功能开发及科学研究提供参考。

1 生物解离大豆蛋白的研究

1.1 生物解离大豆蛋白制备工艺

生物解离即水酶法提取大豆蛋白工艺，主要在前期预处理、不同生物酶的选择、工艺条件的优化以及结合化学改性等方面，做了相关研究，参见表1。

李杨等[2]应用5种蛋白酶进行水酶法提取大豆蛋白，确定碱性蛋白酶作为水解酶最佳条件的蛋白提取率可达到93.76%。李杨等[3]通过响应曲面分析方法确定生物解离挤压膨化工艺最佳参数，试验在最优工艺条件下总蛋白得率可达到94.17%左右，且挤压膨化比湿热预处理提取总蛋白得率提高了近15%。李杨等[4]采用4种（碱性蛋白酶、纤维酶、半纤维酶、果胶酶）的复合水酶法提取大豆蛋白，得到蛋白提取率为85.78%。刘雯等[5]将琥珀酰化与水酶法相结合，优化出最佳改性工艺参数下的总蛋白和多肽与改性前相比分别提高了4.37%和23.46%。刘雯等[6]大豆水酶法的蛋白提取在酶解过程中，利用三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STP）进行磷酸化改性，利用响应面分析优化出最佳改性工艺的总蛋白提取率为94.05%。李杨等[7]利用真空挤压膨化预处理水酶法研究提取大豆蛋白工艺，最优工艺条件比传统湿热预处理工艺提高了近14个百分点。马楠等[8]采用萌发预处理方法辅助水酶法提取大豆蛋白，得出萌发预处理技术可大幅提高蛋白提取率，且作用效果强于粉碎、超声等预处理技术，在最优萌发处理工艺下，蛋白提取率高达91.91%。以上研究从蛋白质提取率角度，可以初步得出碱性蛋白酶水酶法结合挤压膨化预处理技术，是目前生物解离提取大豆蛋白的较为合理工艺，萌发及磷酸化和琥珀酰化对蛋白提取有一定提高。

表1 生物解离大豆蛋白工艺研究Table 1 Study on the technology of biological hydrolysis soybean protein

1.2 生物解离大豆蛋白功能特性

生物解离制取大豆蛋白功能性研究可参见表2。

表2 生物解离大豆蛋白功能性研究Table 2 Study on the function of biological hydrolysis soybean protein

续表2 生物解离大豆蛋白功能性研究Continue table 2 Study on the function of biological hydrolysis soybean protein

江连洲等[9]采用超滤法回收水解液中的蛋白质，建立膜通量影响的模型，优化回收蛋白质质量分数增至88.63%，回收蛋白的溶解性升高，乳化活性和乳化稳定性指数降低，且超滤对低聚糖类物质的脱除效果较好。杨柳等[10]研究3种预处理下生物解离大豆蛋白的功能特性，得出超声波辅助水酶法大豆蛋白的功能特性与大豆分离蛋白接近，优于大豆浓缩蛋白，且好于湿热处理及挤压膨化辅助水酶法大豆蛋白。陈中等[11]研究大豆蛋白的碱性蛋白酶解液在酸性条件下具有良好的稳定性，推测酶解产物间的疏水性相互作用而使酶解液形成不溶性絮凝物，使得蛋白的稳定性和溶出率下降。江连洲等[12]对体外模拟消化过程中大豆蛋白的亚基结构表征中发现，受胃蛋白酶的消化或降解行为影响蛋白的不同组分存在明显差异。王中江等[13-14]探讨热处理条件对大豆分离蛋白体外模拟消化特性得出，伴随加热处理温度的不断升高，水解度曲线变化趋势呈现先上升后下降，二级结构中α-螺旋结构含量变化呈先升高后降低的趋势，而β-折叠结构含量相反为先降低后升高。王瑞等[15]用荧光光谱对大豆分离蛋白体外模拟消化过程不同时间热处理的产物进行分析，表明荧光强度呈现出先上升后下降的变化趋势，且荧光强度随着加热时间的延长，20 min时达到最大值，继续加热荧光强度逐渐下降。江连洲等[16]采用7种蛋白酶酶解挤压膨化大豆粉，得出风味蛋白酶酶解产物苦味值最低，乳化活性和乳化稳定性效果最优。佟晓红等[17]对生物解离大豆蛋白酶解物体外模拟消化抗氧化活性变化进行研究，结果表明经过模拟胃肠消化后，风味蛋白酶酶解物比碱性蛋白酶酶解物抗氧化活性更高，且肽中具有抗氧化活性的氨基酸含量更高。由表2可以得出生物解离后大豆蛋白质的分子量、蛋白结构，溶解性、乳化性、水解性均发生了一定变化，对酶解产物的体外消化模拟研究为生物解离获取的蛋白质、肽进一步利用提供依据。

2 生物解离大豆肽的研究

大豆肽即“肽基大豆蛋白水解物”，大豆蛋白被蛋白酶水解后，再经特殊处理得到的蛋白质水解产物，具有高保湿性、发泡性、非酸沉性、无蛋白变性、加热不凝固、消化吸收率高、易溶于水和流动性好等优加工特性，还具有降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能[18]。

2.1 生物解离大豆肽的制备

生物解离是最常用的生物活性肽生产方法，大豆肽制备的酶制剂主要有碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。周川农等[19]对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和中性蛋白酶4种蛋白酶进行筛选，研究制备小分子大豆肽的复合蛋白酶解最优条件。江连洲等[20]经挤压预处理生物解离大豆得出最佳工艺条件下大豆多肽得率可达到41.36%左右，比未经挤压膨化预处理大豆多肽得率有显著提高。吴瑕等[21]经超声波预处理的酶水解物亚铁还原能力明显强于抗坏血酸但不及丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）（P<0.05），抗氧化能力强于未经超声波处理的酶水解物。王欢等[22]对生物解离大豆水解液富肽豆粉中蛋白类物质亚基组分研究，得出不同微波干燥条件下影响肽组分差异的原因是物相转换率和分子间碰撞机会不同，使得蛋白纤维化聚集形成的速度不同。张巧智等[23]研究大孔吸附树脂对水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能和纯化效果，得出肽段的抗氧化性与其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量具有一定相关性。赵强忠等[24]对大豆分离蛋白胰酶酶解液对酸乳促发酵作用及增黏作用研究，得出胰酶酶解24 h后酶解液对乳酸菌的促生长作用和增黏作用最强。

2.2 生物解离大豆肽的生物活性

生物活性肽在代谢调控中起着重要的作用。本文对目前生物解离大豆生物活性肽的研究综述，参见表3。

上述研究表明，在胃肠消化、食品加工和各种动植物蛋白质的微生物蛋白水解过程中，可以释放出具有生物功能特性的小肽，大豆蛋白是生物活性肽的良好来源。近年来的研究发现，大豆肽具有降血压、降胆固醇、抗氧化和抗癌等多种保健作用。

表3 生物解离大豆生物活性肽研究Table 3 Examples of biofunctional peptides derived from soybean

降血压：采用Alcalase酶制备大豆蛋白ACE抑制肽，显著降低自发性高血压大鼠血压的收缩压[25]。刘佳等[26]制备5种血管紧张素转化酶大豆蛋白抑制肽，其中最适酶Protease N制备肽ACE抑制率达到65.1%。M.Kuba等[27]用酸性蛋白酶水解分离大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白得到降血压肽经过体外胃肠道模拟消化后仍有较高的ACE抑制活性。Shimakage等[28]用蛋白酶处理纳豆，纯化并鉴定5种ACE抑制肽（Ile-Ile、Ile-Asp、Ile-Phe-Tyr、Leu-Phe-Tyr、Leu-Tyr-Tyr）和 8 个豆浆ACE抑制肽的ACE抑制活性比未经蛋白酶处理豆浆高36倍。吴建平等[29]从碱性蛋白酶大豆蛋白水解液中分离出Asp-Leu-Pro和Asp-Gly两种具有降血压效果的活性肽。王升光等[30]研究菠萝蛋白酶、胰蛋白酶复合酶解制备大豆肽，肽活性片段对高血压大鼠模型降压作用显著，高剂量组和降压药卡托普利组相当。王进等[31]用碱性蛋白酶制备的大豆玉米复配肽，ACE抑制率优于单一的玉米肽和大豆肽。孔繁东等[60]研究酶解反应体系发现大豆肽液经酸处理后，活性抑制率略有浮动，热处理后ACE抑制活性略有提升后下降。

抗氧化：蛋白酶在水解大豆蛋白时，蛋白的空间结构被改变，氨基酸活性基团将被暴露，使得小分子的大豆肽比完整的蛋白质具有更高的抗氧化活性[61]。酶解后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白增加了3～5倍，清除自由基活性、抗氧化活性增强[62]。利用芽孢杆菌蛋白酶酶解β-伴大豆球蛋白中分离出6种抗氧化肽[32]。刘丹[33]采用微波辅助碱性蛋白酶酶解大豆浓缩蛋白粉制备抗氧化活性肽，分离纯化F5组分对H2O2诱导HEK-293细胞氧化损伤的保护效果最好。García-Nebot等[34]报道大豆肽lunasin对过氧化氢和叔丁基过氧化氢诱导的人肠Caco-2细胞氧化应激具有保护作用。Zhang等[35]研究发现大豆水解蛋白SPH-I（3 kDa～5 kDa）组分对H2O2诱导人小肠Caco-2细胞氧化损伤具有保护作用，肽的保护作用可能机制是组分中SPH-I富含疏水性和抗氧化性AAs，通过抑制脂质过氧化和刺激抗氧化酶活性来保护Caco-2细胞免受H2O2诱导的氧化应激。Beermann等[36]发现食品级胰蛋白酶和糜蛋白酶水解大豆分离蛋白的抗氧化能力为113 mg TEAC/g。Zhang等对SPH肽的肠上皮转运进行研究，用高效液相色谱串联质谱（liquid chromatographytandemmassspe-ctrometry，LC-MS/MS）对主要吸收的肽进行了鉴定[37]，共鉴定了350种分子量范围为813.47Da～1 982.94 Da的肽，在Caco-2细胞单层渗透液中鉴定出10种主要大豆肽。

降胆固醇：动物实验研究表明，大豆蛋白摄入后，减少肠道对胆固醇的吸收，粪便中胆汁酸的排泄量增加，降低肝脏中胆固醇含量，提高低密度脂蛋白含量，起到降脂作用[38]。也有研究认为大豆蛋白质在胃肠蛋白酶酶解产生生物活性肽，发挥降低胆固醇作用[39]。大豆蛋白循环降低高胆固醇血症患者的甘油三酯和胆固醇[40]。据报道，在大鼠实验中大豆蛋白酶解肽（SPH）比完整的大豆蛋白具有较强的降低血清胆固醇的效果[41]。大豆肽与磷脂结合能共同发挥降低血胆固醇的活性，从大豆11S球蛋白分离N末端的亮氨酸残基的四肽（lpyp），具有降低胆固醇的效果[42]。此外，Zhong等[43]研究大豆肽对小鼠模型降胆固醇作用，发现胆固醇胶束抑制率最高可达48.6%。

减肥：已经确定几种大豆生物活性肽具有减肥的特性，如从大豆11S球蛋白亚基缺失肽的“Leu-Pro-Tyr-Pro Arc”和“Pro-Gly-Pro”被发现有抑制食欲的作用[44]。有证据表明，大豆蛋白可以影响动物的肝脏脂肪合成。膳食大豆蛋白在大鼠肝脏中能降低血浆中甘油三酯的浓度，使得肝脂肪合成酶的活性显著降低，特别是6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸酶、脂肪酸合成酶以及乙酰辅酶A羧化酶的活性，表明大豆蛋白通过部分抑制脂肪酸在肝脏中合成，来降低肝脏甘油三酯和脂肪[63]。Jang等[45]研究黑大豆肽对饮食诱导肥胖小鼠的减肥作用，发现喂食黑大豆肽高脂肪小鼠比没有喂食的对照组体重增长缓慢。研究发现大豆蛋白7S水解物能够释放CCK STC-1细胞受体从而减少大鼠食欲[46]。

免疫调节：据报道，用碱性蛋白酶制备大豆蛋白水解物、不溶性大豆蛋白水解物对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞吞噬起到增殖作用，具有免疫调节活性[47]。张建等[48]在金黄色葡萄球菌表皮创伤感染下的负氮平衡老年小鼠的免疫调节和炎症抑制中发现，大豆蛋白与低聚肽能显著提高体液免疫功能，对炎症反应和肌肉萎缩有一定抑制和恢复作用，且对早期炎症抑制作用更加显著。Maruyama等[49]从胰蛋白酶消化的α-β-伴大豆球蛋白亚基中分离一种具有吞噬作用的激肽。Chang等[50]研究发现用大豆肽Lunasin和细胞因子刺激共同作用的肿瘤细胞具有更高的抑制肿瘤活性。从脱脂大豆粉纯化的Lunasin和其他lunasin样肽，能够通过抑制LPS诱导的巨噬细胞NF-κB途径抑制炎症[51]。

抗癌：一些流行病学和动物研究表明，大豆蛋白可以降低乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的风险。大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）通过多种机制防止癌症，包括增加乳腺分化、对致癌物的致癌物质和信号转导通路相关基因进行调控，使得肿瘤发生活性下降[52]。研究表明大豆lunasin抗癌潜力和作为膳食成分可能有助于乳腺癌的防治[53]。研究使用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，不同大小分子量（＜5 kDa，5 kDa～10 kDa和 10 kDa～50 kDa）能够抑制73%结肠癌、68%肝癌和70%肺癌细胞生长[54]。刘孝琳等[55]将大豆低聚肽（RQRK、HCGAPA）作用于HepG2细胞后，能诱导其细胞凋亡，细胞增殖受到抑制。Rayaprolu等[56]研究大豆多肽组分对血液（CCRF-CEM和Kasumi-3）、乳腺（MCF-7）和前列腺癌（PC-3）细胞增殖的生物活性，多肽组分对癌细胞的抑制率可达68.0%。这种多肽体外抑癌作用，可作为替代癌症治疗中的食品成分或营养补充剂，具有潜在的应用价值。发芽大豆与消化酶水解具有抑制脂肪细胞的增殖，促进脂肪分解作用，对人宫颈癌细胞（Hela）增殖的影响，发芽大豆粉水解蛋白有更高的抗氧化能力和改进的抑制炎症标记物[57-59]。

大豆多肽因其具有生物功能活性而成为研究新药物和功能性食品成分，对其促进肠道健康、调节肠道营养吸收以及对特定的靶器官发挥作用的研究逐渐深入，今后的研究还需要从分子水平研究生物活性肽发挥其作用的机制和肽在医疗方面的作用[18]。大豆生物活性肽工业生产方面上，研究开发生产、分离、提纯和规模化过程中，开发简单、成本效益高的方法，以满足市场需求，促进生物活性肽产业发展。

3 结语

生物解离法可以同时提取油和蛋白粉，并且设备投资少、能源消耗低、废弃物易处理，绿色安全，具有很高的利用价值和开发前景。尽管目前生物解离法提取蛋白质和生产生物活性肽还存在一些问题，如成本高、酶资源少、易失活、产生苦味肽等问题，但随着生物工程、酶工程技术不断发展，这些问题将会得到逐步解决。生物解离大豆蛋白今后需要进一步研究的内容包括：蛋白提取率的最佳酶解工艺参数的优化，蛋白回收、纯化工艺的改进，生物活性肽的分离、功能鉴定、作用机制等。生物解离法制备蛋白、肽技术，是一种具有广阔发展前景的技术，是未来蛋白工业的发展方向之一。