Nisin抗菌肽在食品抗菌防腐中的应用

余楠楠，陈琛

（陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

乳酸链球菌素（亦称乳链菌肽或Nisin）是一种由34个氨基酸残基组成的抗菌多肽[1]。可以降解为人体内的各种氨基酸。无毒副作用，是一种世界公认的、安全无毒的天然食品防腐剂。能有效抑制有害菌的生长繁殖，延长产品保质期，有利于产品的贮存和运输。

Nisin于1928年首次在发酵乳培养物中鉴定，并于1953年在英国作为抗菌剂在市场上销售。1969年，Nisin被联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）批准为安全食品添加剂[2]。Nisin因生产基因稳定、抑菌范围广、安全性高而陆续被许多国家所接受。目前，乳链菌肽在50多个国家获得许可，中国于1990年开始批准使用Nisin。此外，它已经在食品工业中作为不同类型食品的天然生物防腐剂产生了重大影响。

本文对Nisin的不同来源及生产方法进行概述，重点介绍其抗菌活性及其在肉类、乳制品、果蔬保鲜防腐、罐头的口感营养保持和酒精的浑浊变酸抑制中的研究现状，并对其应用前景进行展望，为Nisin的进一步研究和综合开发利用提供一定的参考价值。

1 种类和来源

根据乳酸菌细菌素的结构组成、分子大小、热稳定性、作用方式、输出机制和抑菌能力等，乳酸菌细菌素可被分为三大类。

第一类：羊毛硫抗生素，小的（分子质量＜5 kDa）热稳定肽，高度翻译后修饰，含有特征性多环硫醚氨基酸（如羊毛硫氨酸），甲基羊毛硫氨酸和不饱和氨基酸（如脱氢丙氨酸和2-氨基异丁酸）[3]。ⅠA类线型羊毛硫细菌素，以Nisin为主要代表；ⅠB类球型羊毛硫细菌素，如细菌素Mersacidin；ⅠC类双（多）组分羊毛硫细菌素，以细菌素Lacticin 3147为代表[4]。Nisin是目前最成熟的羊毛硫抗生素。

第二类：小的（分子质量＜10 kDa）细菌素，热稳定的非羊毛硫氨酸含有的肽，除了去除前导肽和形成保守的N-末端硫化物桥之外，它们不经过翻译后修饰。具有两亲性螺旋结构，这使得它们能够插入靶细胞的膜中，导致去极化和死亡[3]。

第三类：溶菌素，高分子量（分子质量>30 kDa）细菌素，是热敏感的大分子抗菌蛋白，它们具有区域型结构，不同的区域有易位功能，结合受体和致死活性[5]。

2 制备技术

在Nisin的生产过程中，乳酸乳球菌和乳链球菌是主要的生产菌[6]，通过诱变来获得高产菌株，并通过改变培养基的配方进一步提高产量。发酵过程中，除产生乳链菌肽的细菌本身差异外，诸如其培养基成分、发酵条件、发酵类型等因素都会影响Nisin的产量。发酵温度、接种量、初始pH值和pH值的变化等因素均会对Nisin效价产生影响[7]。

陈艺强等[8]采用D113弱酸性离子交换树脂对Nisin浓缩液进行静态吸附和动态解吸，然后将解吸液进行盐析、抽滤、烘干和粉碎以获得高纯度的Nisin。其制备的最佳条件为pH 6，吸附时间90 min，解吸剂1 mol/L、盐酸体积/乙醇体积=1.25，解吸速率为1 BV/h，盐析所用氯化钠浓度为23%。此条件下获得的Nisin效价可达34 000 IU/mg，收率达到67.45%，具有良好的工业应用前景。

Özel等的研究中[9]，商业的Nisin通过工业化分批发酵进行生产。在酪蛋白的酶促或酸化分离后，将全脂乳或脱脂乳灭菌，随后的乳清用作底物来大规模生产乳酸乳球菌。发酵条件在pH 6和30℃的温度下优化。在最佳条件下，乳酸乳球菌细胞显示出共同的细菌生长曲线，通常在发酵8 h～10 h后测量的乳酸链球菌素活性最高。发酵后，对发酵物施加发泡程序以分离和浓缩产生的乳酸链球菌素。将发酵物的pH值降至4.5，促进乳蛋白（如酪蛋白和血清）的沉淀。然后，流体进入循环垂直管系统。为了确保含有乳酸链球菌素的液体发泡，添加0.1%吐温80并从底部施加通风，收集在顶部形成的泡沫。在最后阶段，使用氯化钠和丙酮分离乳酸链球菌素，并干燥沉淀物。商业乳酸链球菌素制剂（通常质量比不超过2.5%的纯乳链菌肽含量）用变性乳蛋白和NaCl标准化为106IU/g。如果1 g纯乳链菌肽含有4×107IU，则40 IU的生物活性对应于1 μg的纯乳链菌肽。[国际单位（IU）对应于能够在1 mL肉汤中抑制无乳链球菌的一个细胞的乳链菌肽的量]。因此，商业乳链菌肽制剂的纯度为2.5%，活性为 4×107IU/g。

3 抗菌活性

许多致病性细菌是对Nisin敏感的，Nisin存在的情况下可抑制其活性。Nisin对于营养细胞和芽孢的敏感度在不同属甚至相同物种的不同菌株之间存在差异。Nisin的抗菌活性主要针对革兰氏阳性菌（G+），尤其是芽孢形成菌[6]。对于孢子形成的细菌，Nisin能够抑制其营养形态和孢子的生长。除此之外，Nisin还能抑制一些非孢子形成细菌，例如葡萄球菌（Staphylococcus）、乳球菌（Lactococcus）、乳杆菌（Lactobacillus）、明串珠菌（Leuconostoc）、李斯特菌（Listeria）和微球菌（Micrococcus）等。但Nisin对革兰氏阴性菌（G-）、酵母（yeast）、丝状真菌（Filamentous fungi）、病毒（viruses）抑制活性弱[10]。在一定条件下[如冷冻、加热、降低pH值和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）]处理，Nisin也可抑制一些革兰氏阴性菌（G-），如沙门氏菌（Salmonella）、大肠杆菌（Escherichia coli）、假单孢杆菌（Pseudomonas）、放线杆菌（Actinobacillus）等。

Li等[11]研究高压二氧化碳（high pressure carbon dioxide，HPCD），温和热（mild heat，MH）和乳链菌肽（0.02%）对荔枝汁中天然微生物[包括好氧细菌（aero bic bacteria，AB），酵母和霉菌]的综合影响进行了评估。样品在10 MPa的压力和32、42、52℃的温度下处理 5、10、15、20、25、30 min。当与 HPCD 结合时，温度在好氧细菌、酵母和霉菌的灭活中起着重要作用，特别是对于52℃的好氧细菌和温度≤42℃的酵母和霉菌，Nisin增加了好氧细菌对HPCD和MH（HPCD+MH）联合治疗的易感性。HPCD+MH在52℃下处理15 min，好氧细菌减少了4.19个对数周期，并且通过HPCD、MH和乳链菌肽（HPCD+MH+乳链菌肽）的组合实现了好氧细菌的完全失活。乳链菌肽对酵母和霉菌的失活没有显著影响。试验证明，Nisin的抗菌活性主要针对革兰氏阳性菌，对酵母和霉菌的敏感性较差。

4 保鲜防腐

4.1 肉类

肉类在存放过程中极易受到微生物、氧、酶等影响产生一些不良变化,这将严重影响到肉类的食用及商品价值，并会增加食源性疾病的危害。传统上使用硝酸盐来保存肉类，它们通过发酵肉制品中的微生物硝酸盐还原酶将硝酸盐部分转化为亚硝酸盐，从而抑制梭菌的生长。另一种方法是直接在肉制品中加入亚硝酸盐，亚硝酸盐与仲胺的反应可在某些条件下产生显著水平的亚硝胺[10]。由于亚硝胺具有致癌性，因此其在全世界范围内受到严格的控制。作为一种安全无副作用的天然防腐剂，乳酸链球菌素自然成为肉类保鲜防腐的首选。

Karina等[12]研究温度（10℃～30℃）、脂肪含量（20%～50%）、氯化钠（2.5%～5.0%）和防腐剂浓度[亚硝酸钠（0%～0.015%）、乳酸（50 mmol/L～500 mmol/L）和乳链菌肽（0～100 IU/g）]对肉糜系统中单核细胞增生李斯特菌生长的影响。测试各参数的独立效应和同时效应，并将结果进行数学建模；在每种情况下计算抑制指数。7.5%NaCl的添加抑制了20℃和30℃下单核细胞增生李斯特菌的生长。然而在10℃时，微生物计数约达到106CFU/g。加入50 mmol/L乳酸至pH≤5，可抑制单核细胞增生李斯特菌的生长。乳酸与亚硝酸钠或乳链菌肽的组合显示出抑制效果的增强。而且，乳链菌肽具有低毒性，乳酸（50 mmol/L）和乳链菌肽（20 IU/g）的组合在预防单核细胞增生李斯特菌的生长方面更受欢迎。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计数资料用百分率表示，组间均数比较采用χ2检验；计量资料用表示，采用重复测量方差分析及t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

刘楠等[13]研究了0.5%的乳酸链球菌素对冷藏草鱼片的保鲜效果，通过测定微生物总数、挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、挥发性气味、pH值和K值等来评价草鱼片的品质变化。结果表明，在贮藏过程中，0.5%的Nisin处理的草鱼片的菌落总数、TVB-N值和K值均低于对照组；pH值先降低后升高，电子鼻检测结果表明，Nisin可有效减缓鱼肉风味劣变。因此0.5%的Nisin保鲜剂对冷藏下的草鱼片有较好的保鲜效果，可以延长草鱼片的货架期3 d。乳链菌肽用于肉制品防腐保鲜见表1。

表1 乳链菌肽用于肉制品防腐保鲜Table 1 Application of nisin in preservation of meat products

表1总结了乳酸链球菌素在肉制品保鲜中的一些实例。Nisin的添加可以对革兰氏阳性菌起到广谱抑菌作用，广泛应用于冷却肉保鲜、香肠、西式火腿切片、鱼、虾类海鲜制品、烤肉、家禽熟食等肉制品加工中，具有一定的防腐作用，延长肉制品的保质期。一般储存期间肉系统中乳链菌肽的稳定性主要取决于温度、pH值、活性蛋白酶和储存时间。

4.2 乳制品

牛奶含有丰富的营养成分，易于消化吸收，是理想的天然保健品。但牛奶对微生物来说也是非常好的培养基。奶牛的乳房不是无菌的，即使刚从健康牛乳房挤出的牛乳中微生物很少，在挤乳过程中与外界环境和挤乳容器的接触等多种因素均能增加牛乳中微生物的数量和种类，使牛乳中细菌总数达5×105个/mL甚至更多。因此牛奶非常容易腐败和变质，挤出的生鲜牛乳稍微不注意便会失去价值，故牛乳挤出后必须及时进行加工处理。

Nisin通常被认为是安全的，并且是唯一一种在加工奶酪、牛奶、乳制品、热烘焙面粉和巴氏杀菌中作为天然防腐剂得到实际应用的细菌素。以乳酸链球菌素做食品防腐剂加入鲜牛乳中，不但可以有效延长保质期，且不影响其风味[20]。

Zhao等[21]使用棋盘微量稀释方法评估乳链菌肽和紫苏油（perilla oil，PO）与20种食源性单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌分离株的体外相互作用。在部分抑制浓度指数分别为0.125～0.25和0.19～0.375的供试菌株中观察到协同作用。电子显微镜扫描观察乳链菌肽和PO对单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌细胞壁和膜完整性的影响。结果表明，乳链菌肽和PO存在协同作用且显著抑制牛奶样品中金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的生长。总之，乳链菌肽和PO的组合具有显著的抗菌活性，可以被用于食品工业以控制病原体的生长。

一种新鲜的西班牙奶酪（queso fresco，QF）与李斯特菌污染引起的疾病爆发有关。使用抗菌药物可以解决李斯特菌污染引起的疾病。Gadotti等[22]在QF中添加尼辛（Nisin）、辛酸（octanoic acid）作为抗李斯特菌的成分。QF批次接种约104CFU/g单核细胞增生李斯特菌的5或6菌株混合物并用抗菌药物处理。将样品在4℃下储存3周，并通过在PALCAM琼脂上铺板测定李斯特菌计数。在冷藏期间还评估了对QF指示微生物的影响。与对照相比，所有尼辛和辛酸组合（每种≥0.4 g/kg）对单核细胞增生李斯特菌都有效并在储存20 d后最终计数减少至少3 log CFU/g。处理后大多数菌株混合物的含量立即降低，并且在储存期间它们的数量保持低于103CFU/g。结果表明，尼辛和辛酸的组合可以控制QF中的单核细胞增生李斯特菌，对奶酪的天然菌群几乎没有影响，为控制QF的后处理单核细胞增生李斯特菌的污染提供了解决方案。

Ulpathakumbura等[23]使用Nisin，溶菌酶和乳酸菌（鼠李糖乳杆菌）用作生物防腐剂，而NaNO3用作化学防腐剂。在16℃成熟储存4周，期间测量干酪的物理化学性质，例如pH值、可滴定酸度、质地和水分，评估干酪的感官特性。在乳链菌肽掺入的样品中，风味、质地、气味和总体可接受性的平均感官评分高于其他干酪样品（p＜0.05）。因此，Nisin可以有效地保存切达干酪，且不会影响其质量特性。乳链菌肽用于乳制品的防腐保鲜见表2。

表2 乳链菌肽用于乳制品的防腐保鲜Table 2 Nisin for preservation of dairy products

表2总结了乳酸链球菌素在乳制品保鲜中的一些实例。乳酸链球菌素还可应用在干酪、炼乳、乳粉、乳饮料等各种乳制品中，能有效的抑制革兰氏阳性菌，且不改变其风味。

4.3 果蔬

水果和蔬菜在采摘后基本上不再吸收水和合成营养物质，但它们仍然进行着旺盛的新陈代谢，呼吸和消耗营养物质以维持生命。微生物的侵染会导致植物叶片发生腐烂，最终导致质量严重恶化。果蔬的储藏保鲜即采取有效措施来抑制微生物活动，降低呼吸作用，延缓果蔬的生理衰老，减少营养物质的消耗，最大程度保持其新鲜状态。

邱朝坤等[29]研究溶菌酶和乳酸菌肽对草莓的保鲜效果，使用不同浓度的溶菌酶与Nisin复配液对草莓进行处理，在4℃条件下贮藏，测定草莓的烂果率、失重率、维生素C含量、还原糖含量和总酸含量。结果表明，0.01%溶菌酶与0.10%Nisin复配对草莓保鲜效果最好，贮藏前5 d无烂果。贮藏第5天草莓失重率为8.24%；维生素C含量为109 mg/100 g，下降13.6%；还原糖含量为7.21 g/100 g，上升14.3%；总酸含量为6.21 g/kg，下降 43.1%。

王大平等[30]以猕猴桃果实为试材，采用0.0（CK）、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 的 Nisin 溶液浸泡果实 1 min，在3℃～4℃下贮藏，研究Nisin对猕猴桃果实品质的影响。结果表明，与对照组相比，贮藏12 d后，0.3 g/L的Nisin溶液处理最佳，没有腐烂现象，果实的失重率显著降低，有效抑制了果实在贮藏后期可溶性固形物、可滴定酸和VC量的下降，保持良好的果实硬度，延缓了果实的衰老。

Liao等[31]采用乳链菌肽和温和热处理（Nisin+MH）作为对照，评价了热超声波处理（thermosonication，TS）和0.01%乳链菌肽辅助TS（TS+Nisin）对天然微生物灭活，营养品质保持和新鲜苹果汁保质期延长的影响。通过 Nisin+MH、TS 和 TS+Nisin 在 37、42、47、52 ℃处理新鲜苹果汁5 min～40 min。处理后，每隔5 d在8℃储存期间评估微生物生长。温度对TS和TS+Nisin灭活好氧菌、酵母菌和霉菌起着至关重要的作用，高达52℃的温度可导致苹果汁中微生物细胞的大量灭活。当苹果汁在52℃下经TS和TS+Nisin处理30 min后，新鲜苹果汁的原味保留率[包括89%的抗坏血酸、不可见的颜色变化、褐变度（browning degree，BD）、pH值、可滴定酸度（titratable acidity，TA）和总可溶性固形物（total soluble solid，TSS]值无明显变化，8℃下保质期延长至15 d。乳酸链球菌素对苹果汁中好氧菌有额外的灭活作用，但对酵母和霉菌的灭活作用不明显。这些结果表明，TS和TS+Nisin（0.01%）可能用于生产新鲜的优质苹果汁和和延长其保质期。乳链菌肽用于果蔬的防腐保鲜见表3。

表3 乳链菌肽用于果蔬的防腐保鲜Table 3 Nisin for preservation of fruits and vegetables

表3总结了乳酸链球菌素在果蔬的防腐保鲜中的一些实例。有关乳酸链球菌素用于保存蔬菜产品的文献的主要部分使用乳链菌肽与其他化学试剂或物理处理相关联。Nisin的添加增强了其抑菌效果。

4.4 罐头

Nisin在酸性条件下易溶、稳定好且抑菌性强，因此适用于酸性罐头食品的防腐[1]。使用乳酸链球菌素可以有效阻止抗热微生物的生长繁殖，降低灭菌温度，缩短灭菌时间，同时保证酸性罐头食品的营养、风味和外观。

王莉嫦[36]将乳酸链球菌素添加到鸡汁鲍鱼罐头中，采用正交试验法求得乳酸链球菌素的添加量与杀菌温度，杀菌时间的最佳组合。当乳酸链球菌素浓度为300 mg/kg，杀菌温度为118℃，杀菌时间为15 min时，鲍鱼产品的感官评分最高，内容物（鲍鱼）失水率为23%。达到改善鲍鱼罐头口感、降低生产成本的目的。

4.5 酒精

啤酒经常会受到啤酒片球菌或乳酸杆菌的影响，长时间储存会产生混浊、发黏和变酸等现象[37]，这是在啤酒生产中需要重点控制的问题。Nisin能够消除高达90%的革兰氏阳性啤酒腐败菌[38]，但是对霉菌、酵母菌等抑制效果不明显，因此可以将这一特性应用到酒精饮料如啤酒中在啤酒生产中添加Nisin，可在不影响酵母发酵的前提下，对一些腐败菌起到有效的抑制作用。延长货架期，降低巴氏消毒强度，增强啤酒的品质和风味。

Sun等[39]将覆盆子提取物加入到啤酒的原料发酵材料中，得到覆盆子健康生啤酒，为了延长保质期，在覆盆子健康生啤酒中加入不同浓度的乳酸链球菌素，结果表明乳酸链球菌素对保质期有明显影响，加入0.02 mg/mL乳链菌肽后，覆盆子健康生啤酒保质期为44 d，保质期延长36 d。

5 展望

在食品行业，我国目前为止可使用的防腐剂品种较少，而化学防腐剂因会对人体造成一定的毒害作用，具有一定的局限性。Nisin作为一种天然、低毒、高效的生物防腐剂，在食品工业中具有广阔的应用前景。但是，由于目前对Nisin的研究还处于初级阶段，生产规模小，发酵水平低，成本较高的限制，Nisin的市场售价远远高于化学防腐剂，这使得其广泛的应用受到严重制约。认识到对Nisin研究的不足以后，应加大对Nisin的基础研究和应用，利用生物技术研发出优良的工程，进一步研究Nisin的性质及作用机理。以期实现生产成本低，规模化生产等诸多目标，随着微生物发酵Nisin技术的进步和工业化生产的发展，这些问题都将得到解决，天然生物防腐剂在食品安全行业中也会得到更加广泛的应用。