基于iRhom2/ADAM17信号通路探讨益气活血方治疗出血性血小板病患者的作用机制*

卢芙蓉 秦 铀 沈 霖△ 帅 波 马 陈 徐晓娟 廖 奕 杨艳萍

1华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉 430022

2华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，武汉 430022

出血性血小板病是一组血小板聚集异常反复发作性出血性疾病，1984年由本院沈迪等人首次报告。本课题组前期研究[1]发现，出血性血小板病患者血小板膜上的解离素金属酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)17表达水平明显升高。近年来研究[2-4]表明，非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein 2，iRhom2)是ADAM17关键的耦合子，iRhom2结合ADAM17，促进ADAM17从内质网中外排并调控其活性。基于此，本研究进一步观察了益气活血方治疗出血性血小板病患者的临床疗效及iRhom2/ADAM17信号通路表达变化，旨在探讨iRhom2是否参与了出血性血小板病的病理过程，以及健脾益气活血法治疗出血性血小板病的作用靶点。现将过程报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月—2019年3月就诊于本院中西医结合科的出血性血小板病患者100例，按照随机数字表法分为中药组与西药组，各50例。中药组，其中男17例，女33例；年龄(39.64±13.62)岁，年龄范围为25～67岁；病程(5.68±3.32)年，病程范围为2～13年；出血部位，皮肤瘀点瘀斑46例，月经过多(每次月经量估计在150 mL以上)13例，鼻出血12例，牙龈出血8例，眼底出血2例，球结膜出血2例。西药组，其中男18例，女32例；年龄(37.52±14.18)岁，年龄范围为23～68岁；病程(5.38±4.24)年，病程范围为1～12年；出血部位，皮肤瘀点瘀斑47例，月经过多11例，鼻出血10例，牙龈出血10例，眼底出血2例，球结膜出血1例。2组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 诊断标准

符合《益气活血法治疗出血性疾病》[5]中出血性血小板病相关的诊断标准：患者有多部位出血临床表现，经内科、耳鼻喉科、妇科、口腔科和眼科等科室诊视，未发现特异诊断性病灶；检测血小板计数、出血时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间，未发现明显异常改变；对一项或多项诱聚剂诱导的聚集反应不良或缺如；经瑞斯托菌素(ristocetin)检测血小板排除血小板无力症。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：中药组及西药组患者符合上述诊断标准；正常对照组体检皮肤黏膜无出血症状，血小板聚集检测无异常发现；2周内未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀类中药等影响血小板功能的药物；患者及其家属对本试验知情同意，并得到华中科技大学同济医学院伦理委员会的批准。

排除标准：合并心、肝、肾等重要脏器功能不全或血液系统、免疫系统严重疾病者；妊娠或哺乳期女性；依从性差，不能配合完成治疗者。

1.4 治疗方法

中药组患者予以益气活血方治疗，方药组成为黄芪15 g、党参15 g、白芍15 g、当归10 g、桃仁10 g、甘草6 g；由本院门诊中药房煎制，1剂/d，分2次服用；治疗期间停用其他影响血小板聚集或止血药物。西药组患者予以肾上腺色腙片(江苏亚邦爱普森药业有限公司，国药准字H32023285)口服，2.5 mg/片，2片/次，3次/d。2组患者疗程均为8周。

1.5 观察指标及疗效判定标准

比较2组患者止血疗效，止血疗效判定标准：治疗后出血症状消失，月经量恢复正常为显效；临床出血症状消失，停止治疗8周后偶有肢体瘀斑或牙龈出血为有效；未达到上述标准为无效。止血总有效率=[(显效+有效)例数/总例数]×100%。

比较2组患者血小板聚集率。采集患者肘静脉血，枸橼酸钠抗凝，制备富含血小板血浆，以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)作为诱聚剂，用Chronolog 430型血小板聚集仪检测患者血小板聚集最大聚集率。其中最大聚集率在21%～40%者为反应不良，<20%者为反应缺如。血小板聚集率疗效标准：以血小板聚集率>40%为有效。

比较2组患者治疗前后及正常对照组的血浆iRhom2、ADAM17、pro-ADAM17蛋白表达水平，采用蛋白印迹法(Western Blot)进行检测。采集患者肘静脉血，枸橼酸钠抗凝，制备富含血小板血浆，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min；以12 000 rpm离心15 min后，收集上清，使用Bradford法测定蛋白浓度，-80 ℃保存；上样前加入上样缓冲液，95 ℃煮沸5 min；每个样本取30 μg蛋白上样，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白并转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉常温封闭30 min后，加入iRhom2、ADAM17和pro-ADAM17一抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入辣根过氧化物酶连接的二抗，室温下孵育45 min；ECL-Plus显影曝光，用图像分析软件将其扫描并测定灰度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 iRhom2、ADAM17、pro-ADAM17蛋白表达水平比较

治疗期间，中药组有4例患者未完成观察，其中2例治疗期间服用其他止血药，2例不愿抽血复查；西药组有3例自认为疗效欠佳，服药3～6 d后退出试验；故实际纳入患者共93例。

治疗前，中药组与西药组患者iRhom2与ADAM17蛋白表达水平明显高于正常对照组(P<0.05)。治疗8周后，中药组iRhom2与ADAM17蛋白表达水平较治疗前明显下降，且中药组显著低于西药组(P<0.05)。见图1。

A为治疗前中药组、西药组与正常对照组比较；B为治疗后中药组与西药组比较;1为ADAM17；2为pro-ADAM17；3为iRhom2；**P<0.05

2.2 止血疗效比较

治疗8周后，中药组患者止血总有效率为84.78%，显著高于西药组的44.68 %(P<0.05)。见表1。

表1 2组患者止血疗效比较(例，%)

2.3 血小板聚集率恢复疗效比较

治疗8周后，中药组患者血小板聚集率恢复正常者33例，血小板聚集率恢复疗效为71.74%(33/46)；西药组患者血小板聚集率恢复正常者3例，血小板聚集率恢复疗效为6.38%(3/47)；组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

出血性血小板病是一组由血小板聚集功能异常所导致的出血性疾病，根据临床表现，可归属于中医学“血证”范畴。本课题组经过多年临床观察[6-8]发现，本病患者多存在不同程度的脾虚症状，辨证属脾不统血证，病机为脾气虚弱、统摄无权，血不循经而外溢，治宜健脾益气、活血消瘀，可以选用益气活血方或消瘀止血片进行治疗。

本课题组前期研究[1]发现，该病患者的血管性血友病因子(vWF)和凝血酶共同受体即血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰ b/Ⅸ/Ⅴ及其亚基GPⅠ b α表达水平下调，其主要原因是ADAM17过度水解GPⅠ b α和GP Ⅴ胞外段功能区，导致血小板聚集不良。中药益气活血方治疗该病疗效显著，可明显抑制ADAM17对GPⅠ b α的过度水解。但是，出血性血小板病患者血小板为什么会出现ADAM17对凝血酶受体GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ及其亚基GPⅠ b α的过度水解,中药是通过哪些关键作用靶点而达到抑制ADAM17对GP Ⅰ b α的过度水解功效的，有待进一步探讨。近年来研究[9-10]发现，ADAM17的上游分子伴侣iRhom2能够特异性地调节ADAM17转运、活化及胞外段蛋白水解功能[2]。iRhom2首先在内质网与ADAM17前体蛋白(pro-ADAM17)直接结合，一起转运至高尔基体，pro-ADAM17水解掉一段N端结构域，转化为成熟ADAM17，最后定位于细胞膜，完成蛋白水解[3-4]。有研究发现，激活iRhom2/ADAM17信号通路，可加重血友病出血倾向，血液进入关节，导致骨质流失和滑膜炎。为此，本文采用蛋白印迹法观察了iRhom2/ADAM17信号通路在出血性血小板病中的表达，同时研究益气活血方对其的调节作用。

本项研究结果显示，出血性血小板病患者的iRhom2和ADAM17蛋白表达水平明显高于健康者，表明iRhom2/ADAM17信号通路异常表达参与了出血性血小板病的病理过程。本病治疗前出血性血小板病患者的pro-ADAM17表达水平与健康者比较，差异无统计学意义；进一步提示在出血性血小板病发病过程中，iRhom2通过与pro-ADAM17结合，激活了iRhom2/ADAM17信号通路，从而促进血小板膜表面的ADAM17能够介导GPⅠ b α和GP Ⅴ胞外功能区过度水解，引起血小板凝血酶受体GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ复合物活性下降，导致血小板聚集缺陷，皮肤黏膜出血。中药组治疗8周后，iRhom2、ADAM17蛋白表达水平明显下降，且显著低于西药组；提示益气活血方部分抑制出血性血小板病患者ADAM17对血小板膜表面蛋白水解功能，可能是通过调控其上游基因iRhom2表达、功能或者活性这一关键靶点而实现。

综上所述，采用益气活血方治疗出血性血小板病患者，可显著改善血小板聚集、提升止血效率。iRhom2/ADAM17信号通路参与了出血性血小板病的病理过程，调控iRhom2/ADAM17信号通路可能是益气活血方治疗出血性血小板病作用靶点之一。