酪氨酸激酶抑制剂对CD19 CAR-T细胞在难治/复发Ph阳性急性淋巴细胞白血病中扩增的影响

吕翠翠， 李 新，李 青，穆 娟，王 嘉，袁 婷，江嫣雨，邓 琦

(天津市第一中心医院 血液科，天津 300192)

费城染色体(Philadelphia chromosome, Ph)阳性急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)占成人急性淋巴细胞白血病总发病率的20%～30%。酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的问世显著提高了Ph阳性(Ph+)ALL患者的疗效[1-3]。然而，难治及复发是Ph+ALL患者面临的主要问题。近年来，嵌合抗原受体修饰(chimeric antigen receptor, CAR)T细胞治疗在难治/复发性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)中表现出前所未有的疗效。TKIs可在体外及小鼠体内抑制CAR-T细胞的增殖和杀伤活性[4]，但临床中TKIs与CD19 CAR-T细胞联合应用，TKIs是否抑制后者的功能而影响疗效，目前尚不清楚。本研究利用CD19 CAR-T细胞治疗难治/复发Ph+ALL，同时给予TKIs口服，研究TKIs是否会影响CD19 CAR-T细胞的扩增、疗效及不良反应。

1 资料与方法

1.1病例选择 收集2018年4月至2019年10月在我院确诊的10例难治/复发Ph+ALL患者及16例难治/复发Ph阴性B-ALL患者，根据是否添加TKIs分为两组，TKIs组10例，男7例，女3例，中位年龄54(33，66)岁，临床资料见表1；非TKIs组16例，男9例，女7例，中位年龄27(15，50)岁。研究经我院伦理委员会批准，标本的采集经所有研究对象知情同意并签署知情同意书，以难治/复发B-ALL入组我院“人源化CD19 CAR-T治疗复发/难治B细胞淋巴瘤/急性B淋巴细胞白血病”临床试验(ChiCTR1800019622)。

表1 10例难治/复发Ph+ ALL患者的临床特征

1.2收集临床资料 包括性别、年龄、输注CAR-T细胞时外周血白细胞数和流式骨髓原始细胞比例、免疫分型、细胞遗传学标志、BCR/ABL激酶类型、服用TKIs种类、BCR/ABL激酶区突变类型、造血干细胞移植情况及中枢神经系统受累情况等。

1.3CD19 CAR-T细胞制备及输注 收集患者的单采外周血，使用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，使用磁珠分选试剂盒从提取的单个核细胞中富集CD3+T细胞，并用CD3/CD28磁珠扩增CD3+T细胞，获得的细胞用含有白细胞介素(IL)-2、谷氨酰胺的T细胞专用培养基培养。培养第4天使用流式细胞仪检测培养体系中无CD19阳性白血病细胞残留后，转染含有抗CD19-CAR序列的慢病毒，培养第5天采用流式细胞仪检测CD19 CAR-T细胞的转染效率，培养第12天收获CAR-T细胞。在输注CD19 CAR-T细胞的前4天至前2天给予患者FC方案[F：氟达拉滨30 mg/(m2·d)，C：环磷酰胺300 mg/(m2·d)，共3天]进行淋巴细胞清除预处理， 然后输注CD19 CAR-T细胞1×106/kg。

1.4TKIs口服治疗 自外周血单个核细胞采集日起，TKIs组给予TKIs口服，其中伊马替尼400 mg，1次/d；达沙替尼50～70 mg，2次/d；普纳替尼45 mg，1次/d。

1.5CD19 CAR-T细胞的扩增 分别在CD19 CAR-T细胞输注后第0天、4天、7天、14天、21天以及28天用流式细胞仪检测两组外周血中CD19 CAR-T细胞的比例。

1.6CD19 CAR-T细胞输注的不良反应监测 分别在CD19 CAR-T细胞输注后第0、4、7、14、21及28天用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测两组外周血中细胞因子IL-6、IL-2R、IL-8、IL-10及肿瘤坏死因子α (TNF-α)水平。根据文献分级标准[5]，进行细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS)分级评定。

1.7疗效评价 在CD19 CAR-T细胞输注后14天评估治疗反应，治疗反应包括完全缓解(complete response, CR)、完全缓解伴血细胞不完全恢复(CR with incomplete count recovery, CRi)和无缓解(no remission, NR)。TKIs组于输注CAR-T细胞后每月检测BCR/ABL定量。本研究随访至2020年5月31日或患者死亡，比较两组总生存率(overall survival, OS)和无病生存率(disease free survival, DFS)。

1.8统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以中位数(四分位数)[M (Q1，Q3)]表示，采用两独立样本t检验；计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法；等级资料比较采用Mann-whitney秩和检验；采用Kaplan-Meier法计算OS和DFS，组间差异采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1临床资料 与非TKIs组相比，TKIs组年龄更大，高危细胞遗传学标志更多，但两组在性别、输注CAR-T细胞时外周血白细胞数和流式骨髓原始细胞比例、免疫分型、造血干细胞移植及中枢神经系统受累方面差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组临床特征比较

2.2CD19 CAR-T细胞的转染率和输注情况 TKIs组和非TKIs组CD19 CAR-T细胞的转染率均值分别为55.96%和57.43%，差异无统计学意义(t=1.518，P=0.269)。TKIs组和非TKIs组输注CD19 CAR-T细胞的均值分别为(1.08±0.02)×106/kg和(1.10±0.03)×106/kg，差异无统计学意义(t=0.957，P=0.328)。

2.3CD19 CAR-T细胞扩增情况 两组外周血中CD19 CAR-T细胞峰值均出现在输注后第7～14天，在输注14天以后逐渐下降。TKIs组外周血中CD19 CAR-T细胞峰值为41.80%(25.19%, 65.14%)，非TKIs组外周血中CD19 CAR-T细胞峰值为14.80%(3.32%, 33.74%)，差异有统计学意义(t=3.220，P=0.0037), 见图1。

2.4两组细胞因子比较 两组细胞因子在输注CD19 CAR-T细胞后第4～14天升至峰值，第14天以后逐渐下降。两组细胞因子峰值差异均无统计学意义，见图2。

2.5两组不良反应比较 TKIs组CRS为1～4级，其中1级30%(3/10)，2级30%(3/10)，3级30%(3/10)，4级10%(1/10)。非TKIs组CRS为1～3级，其中1级62.5%(10/16)，2级18.75%(3/16)，3级18.75%(3/16)，差异无统计学意义(P=0.135)，见图3。

2.6随访及疗效观察短期疗效 TKIs组CD19 CAR-T治疗后第14天均达CR/CRi；非TKIs在CD19 CAR-T治疗后第14天，CR率为75%(12/16)，NR率为25%(4/16)，差异无统计学意义(P=0.136)。TKIs组在输注后1个月BCR/ABL融合基因定量均为0。远期疗效：非TKIs组有5例患者行异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)。至随访截止日期，中位随访时间为8个月，TKIs组中位OS时间为10.0个月，非TKIs未移植组中位OS时间为6.0个月，非TKIs

移植组尚未获得中位OS，差异无统计学意义(χ2=1.746；P=0.418)。TKIs组中位DFS时间为8.0个月，非TKIs未移植组中位DFS时间为4.0个月，非TKIs移植组尚未获得中位DFS，差异无统计学意义(χ2=1.644；P=0.440)，见图4。

3 讨 论

在TKIs问世以前，Ph+ALL患者易复发、缓解期短、预后差。随着TKIs的应用，Ph+ALL的疗效显著提升。然而，难治/复发仍是Ph+ALL亟待解决的关键问题。TOGASAKI等报道发现，HSCT能显著降低Ph+ALL复发率[6]。当前，对于难治/复发Ph+ALL患者，异基因HSCT仍是首选治疗方式。然而，由于高龄或缺乏供者，部分患者没有条件进行异基因HSCT。

CAR-T细胞是通过基因工程改造的T淋巴细胞，能特异性识别并杀伤肿瘤细胞[7]。CAR-T治疗使B-ALL的疗效大大改善， 其中CD19 CAR-T在成人及儿童难治复发性CD19+ALL的完全缓解率在70%～90%[8-12]。因此，CAR-T是没有移植条件的难治/复发Ph+ALL患者的新的治疗选择。本研究收集了10例难治/复发Ph+ALL患者的临床资料，其中8例患者因高龄或缺乏供者无法行异基因HSCT， 另2例患者行异基因HSCT后复发，故10例患者均选择CD19 CAR-T治疗，同时给予TKIs口服。

研究表明，TKIs达沙替尼在体外及小鼠体内能抑制CAR-T细胞的扩增和杀伤活性，去除达沙替尼后，CAR-T细胞的增殖和杀伤活性可以恢复，因此达沙替尼对CAR-T细胞起到“开关”的作用[4]。在临床实践中，选择CD19 CAR-T治疗的Ph+ALL患者一般会常规服用TKIs，但TKIs是否抑制人体内CD19 CAR-T的功能及疗效，目前尚不清楚。本研究首次表明TKIs可以促进CD19 CAR-T细胞在复发Ph+ALL中的扩增。尽管与非TKIs组相比，TKIs组年龄更大，高危细胞遗传学标志更多，但两组OS和DFS均差异无统计学意义，两组CRS分级和细胞因子分泌水平差异无统计学意义，表明TKIs既不抑制CAR-T的疗效，也不加重其不良反应。

在短期疗效方面，尽管TKIs组与非TKIs组差异无统计学意义，但TKIs组 CR率整体要高于非TKIs组。因此服用TKIs能在短期内提高疗效，与非TKIs组相比，统计学上的无差异可能是入组病例数较少的缘故。

此外，本研究结果与此前报道的TKIs在体外及小鼠体内实验结果完全相反， 这可能是由于体内外及不同物种之间环境差异造成的。CAR-T细胞在体内的药代动力学取决于多种内在和外在因素，如CAR-T产物表型和成分、肿瘤负荷、输注前的淋巴消耗治疗等。此外，不同来源的CAR-T细胞的功能活性不同，达到同一输注效果所需的CAR-T数量不同[12-13]。小鼠与患者以上这些因素的差异及体内外环境的不同可能导致研究结果的不同。

综上所述，本研究首次表明，TKIs促进CD19 CAR-T细胞在复发Ph+ALL中的扩增，不抑制CD19 CAR-T细胞的疗效，不加重其不良反应。CD19 CAR-T联合TKIs是没有条件行异基因HSCT的复发Ph+ALL的新的选择，其疗效显著，安全性好。