CRISPR/Cas9技术在园艺作物中的研究进展

黄少勇 ,王 娟 ,王柏柯 ,李 宁 ,唐亚萍 ,杨生保 ,杨 涛 ,张国儒 ,帕提古丽·艾斯木托拉 ,高 杰,余庆辉

(1．新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】尽管园艺作物产量在不断增加，但是品种的多样性和营养价值却在下降[1]。由于长期的驯化育种导致园艺作物遗传多样性变得狭窄以及野生近缘种的基因交流受到抑制而导致生殖隔离。获得具有多样性和理想特性的遗传资源是园艺作物品种改良的重要环节。传统育种在很大程度上依赖于现有的自然等位基因变异,或通过化学诱变剂或辐射来产生突变体[2]，作物改良过程费时又费力。与传统育种技术相比，重组DNA技术允许将所需基因转移到园艺作物中，为作物提供新的基因型和表型，从而提高产量，提升作物品质，增强逆境适应能力，延长货架期等。其中CRISPR/Cas9技术，可以快速有效地改善重要的农艺性状，如生物和非生物胁迫的响应能力以及作物果实品质等。一方面随着越来越多植物基因组测序完成，为园艺作物的基因定位、结构与功能分析研究奠定了基础，同时也为园艺作物改良提供重要参考信息。另一方面，不同园艺作物之间的巨大差异使得CRISPR/Cas9技术需要不断地进行改良。园艺作物之间、甚至植物与动物之间的CRISPR/Cas9技术也可以相互借鉴与改进。【前人研究进展】CRISPR/Cas9技术在植物中的研究多集中在模式植物如拟南芥、水稻、烟草和番茄等，而在园艺作物中，如红薯[3]、蘑菇[4]、苹果[5]、柑橘[6]和马铃薯[7]等也有不少的研究报道。【本研究切入点】关于CRISPR/Cas9技术在园艺作物中的研究报道逐年增多，技术本身也在不断改进。回顾近年来基因编辑技术在园艺作物中的研究进展。【拟解决的关键问题】总结近年来园艺作物中CRISPR/Cas9技术的研究现状与发展趋势,为园艺作物品种改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

通过查阅国内外相关文献资料，收集与园艺作物相关的CRISPR/Cas9前沿技术研究报道。

1.2 方 法

整理汇总，并分析园艺作物的CRISPR/cas9技术研究进展。

2 结果与分析

2.1 CRISPR的发现及其作用机理

2.1.1 CRISPR的发现与分类

1987年，荷兰科学家首次在大肠杆菌基因组中发现CRISPR系统，用于防御噬菌体和外源质粒的入侵[8]。2005年，3个不同的研究团队同时发现，许多CRISPR间隔子的短序列与来源于染色体外DNA的序列高度同源，表明CRISPR与特异性免疫之间存在一定的关系[9-11]。

一个完整的CRISPR/Cas系统由3部分组成：CRISPR序列、富含AT碱基的先导序列和可编码cas蛋白的cas基因操纵子[12]。通常根据Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系统可分为3种主要类型：I型和III型系统使用的是大型多核蛋白质复合物进行靶向与结合，而II型系统只需要1种蛋白质，即Cas9 (CRISPR-associated protein 9)，该蛋白质用于RNA引导的双链DNA的识别和断裂，形成RuvC和HNH 2个不同的区域[13]。Cpf1是第2类V型CRISPR系统中的另1种核酸内切酶，在植物基因组编辑中也同样有效[14]。由于作用机制的不同，每一种用于基因组编辑的核酸内切酶都具有独特的特性。

2.1.2 CRISPR/Cas9的作用机理

一般来说，CRISPR/Cas9系统对外来DNA的作用可分为3个阶段：一是获得阶段，识别入侵的DNA，并将从靶DNA衍生的间隔序列插入宿主CRISPR序列用于建立免疫记忆；二是表达阶段，Cas9蛋白被表达，CRISPR序列被转录成前体RNA转录本(pre-crRNA)。随后1个非编码反式激活的CRISPR RNA (crRNA)与pre-crRNA和Cas9蛋白结合，将它们加工成成熟的RNA，即crRNAs；3是干扰阶段，成熟的crRNAs引导Cas9蛋白识别合适的DNA靶点，然后切割并降解入侵的外源DNA[15]。

Cas9蛋白切割DNA产生1个DSB (double-strand break site, 双链断裂位点)，从而触发细胞DNA修复机制。在缺乏同源修复模板的情况下，易错的NHEJ (non-homologous end joining, 非同源末端连接)途径被激活，并在DSB位点引入随机的插入，删除甚至替换，这种方式通常会导致基因功能的缺失。另外，如果获得与DSB位点周围序列同源的供体DNA模板，则会激活精确的HDR (homology-directed repair, 同源重组修复)途径，执行精准的基因修饰突变，包括基因敲入、删除或突变[16]。目前，最常用的Cas9蛋白来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes, Sp)。利用该系统进行基因组编辑，需要合成单链向导RNAs (single-guide RNAs, sgRNAs)来构建CRISPR/cas9表达盒。然后，通过识别NGG的PAM(protospacer adjacent motif, 前间区序列邻近基序)的sgRNAs引导Cas9蛋白到特定的基因组位点，并匹配目标DNA序列[17]。

自2013年成功利用CRISPR/Cas9系统编辑植物基因组以来，已经将其转化为更强大的工具。目前，CRISPR/Cas9具有多基因编辑功能，即1次编辑多个基因[18]。此外，CRISPR/Cas9不仅可以靶向1个编码基因的开放阅读框(ORF)[19]和非编码区[20]，还可以靶向包括长链非编码RNA (ncRNA)、microRNA[21]及启动子区[22]。还可以在不需要DSB的情况下，在基因组靶点上实现单碱基替换[23]。

2.2 CRISPR/Cas9技术在园艺作物中的应用

2014年，CRISPR/Cas9系统首次在番茄中应用，研究人员将Argonaute7基因敲除后使番茄叶片产生Wiry表型[24]。随着CRISPR/Cas9技术的发展，在越来越多的园艺作物中得到应用，包括草莓[25]、香蕉[26]、葡萄[27]、苹果[28]、西瓜[29]和猕猴桃[30]。该文总结了CRISPR/Cas9在番茄等园艺作物上的研究应用，主要包括：影响植物生长发育、提高果实品质、响应生物与非生物胁迫，以及作物驯化等。表1

表1 CRISPR/Cas9在番茄等园艺作物上的应用

2.2.1 影响植物生长发育

草莓作为1种模式生物，常被用于特定基因的功能分析。利用CRISPR/Cas9技术敲除草莓ARF8 (auxin response factor 8, 生长素响应因子8)，证实arf8纯合突变体比野生型植株幼苗生长快[25]。据报道，番茄TM6基因(tomato MADS-box gene 6)在雄蕊发育过程中起主要作用[31]。为了证明其在草莓中的功能，利用CRISPR/Cas9系统构建1个八倍体的tm6突变体进行表型分析，发现其花药存在严重缺陷，表明TM6在草莓花发育中同样起着重要作用[32]。此外，利用CRISPR/Cas9策略研究YUCCA10 (YUC10)基因在草莓果实发育的生长素合成过程中的生物学作用。当敲除YUC10时，在yuc10突变体中观察到游离生长素显著减少[33]。除了草莓的功能性研究外，越来越多的研究人员正致力于CRISPR/Cas9介导的基因组编辑研究，以期改良其它园艺作物。

成功构建了靶向TCS (tea caffeine synthase, 咖啡碱合成酶)的CRISPR/Cas9基因编辑载体，为茶树其他基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建，提供了借鉴方法[34]。研究发现，杨树AZF2 (Arabidopsis zinc-finger protein 2, 拟南芥锌指蛋白2)基因可能参与了根的发育。利用CRISPR/Cas9方法将新疆杨PalAZF2定点敲除，构建palazf2新疆杨突变体植株。研究发现，敲除PalAZF2的突变体植株的生根速度减慢，推测PalAZF2基因与根的生长有关，参与调控新疆杨的生长发育[35]。CRISPR/Cas9技术在重要农艺性状改良方面同样具有巨大的优势。以甘蓝BoPDS(Phytoene desaturase, 八氢番茄红素脱氢酶)为靶基因，利用CRISPR/Cas9系统实现甘蓝基因组的精准编辑。在转基因T0代植株中观察到白化的叶片表型，37.5%的转基因植株在BoPDS基因预期位置上发生核苷酸缺失突变。在BoPDS的同源基因Bol016089中也检测到在相应位置上发生突变。研究结果表明，CRISPR/Cas9系统可作为有效改良甘蓝品种的基因编辑工具[36]。

2.2.2 提高果实品质

果实品质既包括果实大小，颜色和货架期等外在品质，也包括口感风味与营养物质等内在品质。在番茄果实中，花心皮产生的子房室数对番茄果实大小影响最大[37]。经典的CLAVATA-WUSCHEL(CLV-WUS)干细胞通路可以调控番茄的心室数。利用CRISPR/Cas9技术诱导番茄SlCLV3启动子突变，获得的转基因植株比野生型植株具有较多的心室和较大的果实[38]。利用CRISPR/Cas9技术分别以PSY1 (phytoene synthase 1，八氢番茄红素合成酶1)、MYB12 (MYB transcription factor 12, MYB转录因子12)和ANT2 (Anthocyanin 2, 花色苷2)为靶位点，成功地培育出黄色[39]、粉红色[40]和紫色[41]番茄。通过CRISPR/Cas9技术可以使RIN(ripening inhibitor)[42]或者DML2 (DNA demethylase 2)[43]失活，延缓果实的成熟时间，从而延长货架期。有研究报道，在不降低番茄口感和营养品质的情况下，通过沉默PL (pectate lyase, 果胶裂解酶)[44]和ALC (alcobaca)[45]成功地控制果实的软化，这表明CRISPR/Cas9系统将是园艺作物果实品种改良的一个重要工具。

已有报道利用CRISPR/Cas9技术通过调节其代谢途径中关键基因的表达来提高果实中花青素(Anthocyanin)[46]、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)[47]和番茄红素(lycopene)[48]的含量。此外，研究人员还利用CRISPR/Cas9鉴定到番茄中苹果酸(malate)含量的关键调控基因ALMT9 (aluminum-activated malate transporter 9, 铝激活苹果酸转运蛋白)[49]。

2.2.3 响应生物与非生物胁迫

园艺作物通常面临各种生物与非生物的胁迫，随着基因编辑技术的飞速发展，特别是CRISPR/Cas系统的建立，为植物抵御各种胁迫提供了新方法[50,51]。通过定位外壳蛋白和基因组的复制酶位点，利用CRISPR/Cas9系统对抗番茄黄叶卷曲病毒进行了基因工程设计。发现编辑的番茄植株比野生型番茄表现出高效的病毒抗性，积累的病毒基因组DNA较少，且这种免疫活性可以世代传递[52]。通常，植物RNA病毒需要宿主因子以维持其生命周期，如eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)。利用CRISPR/Cas9系统构建突变体破坏eIF4E的功能，对黄瓜叶脉黄变病毒、西葫芦黄花叶病毒和番木瓜环斑花叶病毒均具有免疫功能[53]。此外，敲除番茄DCL2 (Dicer-like 2)基因，获得的dcl2突变体在感染马铃薯X病毒(potatovirusX,PVX)、烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)和番茄花叶病毒(tomatomosaicvirus,ToMV)时表现出相应症状，说明DCL2参与了对RNA病毒的防御[54]。利用CRISPR/Cas9技术使内源性香蕉条纹病毒(endogenousbananastreakvirus,eBSV)失活，发现与未经编辑的对照组相比，75%的被编辑植株无症状表现[55]。

在拟南芥中，DMR6 (downy mildew resistant)属于2-氧戊二酸铁(II)依赖氧合酶超家族成员，参与水杨酸的内稳态，过表达AtDMR6后，转基因植株对霜霉病的敏感性增强[56]。而利用CRISPR/Cas9技术对番茄DMR6同源基因突变，发现dmr6突变体对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、辣椒疫霉、黄单胞菌在内的多种病原菌均表现出了抗病性，且该突变对植株无危害[57]。Mlo1 (Mildew resistant locus O 1)编码一种膜相关蛋白，对引起白粉病的真菌具有敏感性。利用CRISPR/Cas9技术获得mlo1功能缺失的番茄突变体，发现该突变体对白粉病真菌(Oidiumneolycopersici)具有完全抗性[58]。值得注意的是，通过自交转化株T0将转移DNA (T-DNA)分离，并在子代中鉴定到无T-DNA插入的mlo1突变体，这些突变体被认为是无转基因作物。MLO7 (mildew resistance locus O 7)和WRKY52 (WRKY transcription factor 52)分别与白粉菌(Erysiphenecator)和灰霉病菌(B.cinereal)抗性相关。Malnoy等[59]和Wang等[60]分别在苹果和葡萄中，利用CRISPR/Cas9系统获得的功能缺失突变体对白粉菌和灰霉病菌免疫性增强。番茄果实极易感染灰霉病，利用CRISPR/Cas9技术敲除掉MAPK3 (Mitogen-activated protein kinase 3)后，间接增强SlJAZ1和SlMYC2的表达，从而证明MAPK3在番茄抗灰霉病中起着积极的作用[61]。柑橘溃疡病是由柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri)引起的，通过CRISPR/Cas9编辑柑橘LOB1 (lateral organ boundaries 1)的启动子区域获得抗柑橘溃疡病的突变植株对柑橘溃疡病表现出高度的抗性[62]。

通常BZR1 (Brassinazole resistant 1)调节油菜素内酯(brassinosteroid, BR)反应，参与BR介导的发育过程。研究人员在番茄中利用CRISPR/Cas9系统构建CRISPR-bzr1突变体，证实BZR1还通过调节细胞膜受体蛋白激酶FERONIA (FER)基因参与番茄的耐热性[63]。同时，番茄也是1种对低温敏感的作物，其果实品质容易受低温胁迫影响。研究发现CBF1 (C-repeat binding factor 1)保护植物免受冻害，通过CRISPR/Cas9获得的cbf1突变体表现出比野生型植株更严重的冻害症状[64]。此外，MAPK3不仅具有番茄灰霉病抗性，还能通过保护细胞膜免受氧化损伤的方式参与番茄的干旱胁迫响应[65]。

2.2.4 作物的驯化

从野生植物演变为栽培作物的过程叫做植物驯化。传统的园艺作物驯化方式是经过长期的人工选择获得理想表型。而CRISPR/Cas9则可以加快引种驯化的过程。作物产量很大程度上取决于花的数量，而花序结构决定花的数量。在番茄中，多花花序的形成依赖于转录因子TMF(TERMINATING FLOWER)的精确调控，研究发现TMF蛋白和3个番茄BOP (blade-on-petiole)同源基因相互作用，形成转录复合物。利用CRISPR/Cas9分别构建CR-slbop1/3、CR-slbop1/2、CR-slbop2/3等双突变体和CRISPR-bop1/2/3三突变体，这些缺失突变体花序都极其简化。证明SlBOP与其同源基因功能相似，影响花序结构，特别是CRISPR-bop1/2/3三突变体的开花速度比野生型快，但具有极其简化的花序[66]。单性结实是园艺作物理想的农艺性状，利用CRISPR/Cas9敲除番茄的AGL6 (AGAMOUS-LIKE 6)基因获得突变体为单性结实表型，由于该突变不会对果实的重量和外形有影响，没有引起同源基因的变化，因此，AGL6是单性结实的一个理想基因[67]。赤霉素或生长素信号的升高可诱导植物的单性结实，由参与生长素信号通路的IAA9 (indole-3-acetic acid inducible 9)和ARF7 (auxin response factor 7)基因敲除产生的突变体均为单性结实[68]。此外，番茄果实的果柄无分离层更便于机械化采收，育种家们利用CRISPR/Cas9技术培育出番茄MBP21 (MADS-box protein 21)功能缺失的突变体mbp21为无果节表型[69]。过去要通过漫长的人工驯化工作才能获得这些理想的园艺作物表型，现在通过CRISPR/Cas9体系可以更快捷，高效的将其引入园艺作物中。

通过CRISPR/Cas9技术还可以将理想的农艺性状引入野生植物中，从头驯化野生种是另1种有效的园艺作物驯化策略。利用多重CRISPR/Cas9技术编辑编码序列、顺式调控区或上游开放阅读框，将与形态、花果产量和抗坏血酸合成相关的理想性状引入4个耐胁迫野生番茄材料中。不含Cas9基因的编辑植株后代具有驯化的表型，但仍保持了亲本的抗病性和耐盐性[70]。姑娘果是1种生长在中美洲和南美洲的野生茄科植物，利用CRISPR/Cas9，分别将3种控制株型、花量和果实大小的番茄同源序列(SP, SP5G和CLV1)引入姑娘果中，从而改善了姑娘果的主要农艺性状[71]。应用CRISPR/Cas9技术，通过引入远缘模式植物的已知农艺性状来加速各种野生植物的驯化过程成为了可能。

3 讨 论

3.1 尽管CRISPR/Cas9系统本身还存在编辑效率低、脱靶风险高等缺点，在各种园艺作物中建立高效的CRISPR/Cas9体系还存在许多局限和挑战，但是随着研究人员对CRISPR/Cas9体系不断研究发现，影响CRISPR/Cas9系统编辑效率的主要因素包括2个重要元件(Cas9和sgRNA)。因此，对Cas9蛋白的改造以及提高sgRNA的特异性是提高编辑效率，降低脱靶风险的有效途径。

3.2 对Cas9进行改造，使其中1个结构域失活，得到突变型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶。Cas9蛋白经过这一改造，CRISPR/Cas9技术应用时就需要设计2条sgRNA，该策略可使脱靶效应降至1/1 000[72]。科研人员对Cas9稍加改动，使其迅速扩增，积累突变，再识别PAM序列并对临近DNA进行切割，最终获得CRISPR/Cas9不仅提高了编辑效率，同时还降低了脱靶风险[73]。将CRISPR/Cas9系统中Cas9的2个保守的内切核酸酶结构域进行突变，使Cas9蛋白失去内切核酸酶活性，称之为dead Cas9 (dCas9)。dCas9不能切割DNA但仍能与sgRNA形成复合物并与特定DNA序列结合。该系统不会造成DNA双链断裂，可避免在特定基因上的永久突变对宿主的影响。尤其是在调控基因表达中的作用，既可用于激活特定基因的表达(CRISPR activation, CRISPRa)，也可用于抑制特定基因转录(CRISPR interference, CRISPRi)。可用于实现对园艺作物表观基因组更好的控制[74]。

3.3 在提高sgRNAs特异性方面，成功构建了1种基于靶向差异sgRNAs的代理报告系统(Discriminated sgRNAs based SurroGate system, DisSUGs)，实现了对胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)编辑后细胞的高效富集。经DisSUGs系统筛选后，平均75%的再生植株都实现了碱基编辑，比常规编辑方法提高了3～5倍，其中ABE的效率平均可以达到81%左右[75]。近期报道，在大豆中通过筛选高效sgRNA，提升编辑效率的策略。设计了70个sgRNA靶向102个大豆基因，通过16次转化得到407个T0株系，覆盖所有sgRNA，多数sgRNA有3个以上独立株系，整体基因编辑效率为59.2%，其中35.6%为多基因突变[76]。随着CRISPR/Cas9体系的不断成熟完善，越来越多园艺作物CRISPR/Cas9系统的成功构建，该技术在生产实践上的应用范围将越来越广。

4 结 论

回顾近年来运用CRISPR技术在园艺作物的生长发育、果实品质、响应各类胁迫和作物驯化等方面的主要成就，尤其是利用CRISPR技术编辑的作物原生质体中无外源DNA传递，可以快速高效地获得理想表型的园艺作物新品种，加快具有优良表型的园艺作物培育生产。园艺作物种类繁多，但是其中大部分园艺作物的遗传信息仍然缺乏。随着全基因组与泛基因组等测序工作的不断完成，越来越多的园艺作物遗传信息得以阐明。基于重要农艺性状(如抗逆、抗病、花期、育性和高度等)基因定位信息不断完善，以及对决定园艺作物性状的主要基因的挖掘，构建不同园艺作物的CRISPR/Cas9体系，将加快园艺作物在基础研究和应用生产上的发展。