多指标正交试验优选葆肾合剂最佳提取工艺*

冯子芳，袁晓航，陈晓伟，费倩倩，费逸明

（南京中医药大学附属无锡市中医医院，江苏 无锡 214000）

葆肾合剂是治疗早中期慢性肾脏病的经验方，由芡实、黄芪、石韦、金樱子、覆盆子等组方，补肾兼顾健脾，以补后天而实先天，固摄之时不忘清利，摄而不滞，利而不伤。中药制剂通过多成分、多靶点协同发挥整体药效，因此，多指标综合评分是优化提取工艺的重要方法［1-2］。芡实益肾固摄［3-4］，黄芪益气固摄，米仁根清利湿热，但相关研究少，故不选择其作为含量测定的成分。黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷为其有效成分，相关检测手段成熟，分离度好［5-7］。覆盆子中的鞣花酸、石韦中的绿原酸均为药材主要有效成分，理化性质稳定。故选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸、绿原酸作为含量测定指标成分。本试验中以有效成分含量和浸膏得率为考察指标，采用多指标综合评分方法［8］优选最佳提取工艺，明确葆肾合剂的物质基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪，包括DAD 二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）；BSA224S-CW 型电子天平（德国Sartorius 公司，精度为十万分之一）；KQ-100 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率为100 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号为111920-201606），鞣花酸对照品（批号为111959-201602），绿原酸对照品（批号为110753-201817），均购自中国食品药品检定研究院；中药饮片（产品信息见表1）经无锡市中医医院副主任中药师胡敏敏鉴定为合格品；葆肾合剂（医院制剂，批号分别为191201，191202，191203）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 中药饮片产品信息

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：WatersXbridgeC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～10 min 时92%B，10～12 min 时92%B→89%B，12～50 min 时89%B；检测波长：326 nm（绿原酸），254 nm（鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷），采用双波长检测；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。在此色谱条件下，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰、鞣花酸峰和绿原酸峰与其他峰达基线分离。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷32 μg/mL、鞣花酸157.8 μg/mL、绿原酸53 μg/mL的混合对照品溶液。精密量取3 批样品（批号分别为191201，191202，191203）1.5 mL，置5 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声（功率为100 W，频率为40 kHz）10 min，放冷，加甲醇定容，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按葆肾合剂制备工艺，分别制备缺黄芪、缺覆盆子、缺石韦的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密移取上述混合对照品溶液适量，加甲醇溶解，稀释成不同质量浓度的混合对照品溶液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，以各对照品质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。结果见表2。

表2 线性关系考察结果

精密度试验：取同一对照品溶液适量，连续进样6 次，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸的峰面积。结果的RSD 分别为0.44%，0.27%，0.33%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为191202）适量，依法平行制备6 份供试品溶液。精密吸取10 μL 分别进样测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸峰面积的RSD 分别为1.72%，2.09%，1.42%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，16 h 时按拟订色谱条件进样测定，每次10 μL。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸峰面积的RSD 分别为0.79%，1.98%，2.63%（n=6），表明供试品溶液在16 h 内稳定。

加样回收试验：精密量取样品（批号为191202）0.75 mL，按1 ∶1（供试品溶液和混合对照品溶液中有效成分质量比）精密加入混合对照品溶液0.5 mL，依法平行制备6 份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸的平均加样回收率分别为98.15%，97.08%，97.82%，RSD 分别为2.51%，2.19%，2.52%（n=6）。

2.2 正交试验设计

试验方案：按处方量称取全方药材，共72.5 g，分别取9 份。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸的量为有效成分指标，采用正交设计试验L9（34），考察煎煮时间（因素A）、煎煮次数（因素B）、加水量（因素C）和浸泡时间（因素D）对提取效果的影响，因素水平见表3。按正交试验方案，过滤、合并提取液，滤液浓缩至200 mL，得9 个正交试验的样品溶液。

浸膏得率测定：精密量取样品溶液25 mL，置干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至恒重。结果见表4。

表3 正交试验因素水平表

表4 水提工艺正交试验结果

有效成分含量测定：依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别测定9 份正交试验供试品溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸含量，各成分的质量分数以各单味药材投料量计，如鞣花酸质量分数=鞣花酸提出量（mg）/覆盆子投料量（g）。结果见表4。

综合评价及结果分析：以有效成分的质量分数和浸膏得率进行综合评分，评分时以各指标的试验最大值为参照，将数据进行归一化，再给以不同权重［9］，参考君臣佐使分配权重，综合评分=（样品浸膏得率/样品中最大浸膏得率）×30% ×100+（样品毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数/样品中最高毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数）×30% ×100+（样品鞣花酸质量分数/样品中最高鞣花酸质量分数）×20% ×100+（样品绿原酸质量分数/样品中最高绿原酸质量分数）×20% ×100，综合评分越高，表明提取效果越好。以综合评分对试验结果进行直观分析和方差分析［10］，结果见表4 和表5。由表4 可见，各因素影响顺序为煎煮次数＞煎煮时间＞浸泡时间＞加水量；A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，D1＞D3＞D2，优选水平组合为A3B3C3D1。由表5 可见，煎煮次数对提取影响显著（P＜0.05），而加水量、煎煮时间和浸泡时间均无显著影响。故确定最佳工艺为加10 倍量水，浸泡30 min，提取3 次，每次2.0 h。

表5 方差分析结果

2.3 验证试验

为验证工艺的合理性和稳定性，需进行验证试验［11］。按处方比例称取3 份药材72.5 g，加10 倍量水浸泡30 min，回流提取3 次，每次2.0 h，合并滤液，浓缩至200 mL。测得浸膏得率和毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸、绿原酸含量见表6。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、鞣花酸和绿原酸含量的RSD 分别为1.66%，0.79%，2.10%（n=3），表明工艺稳定可行、重复性好。

表6 最佳工艺验证试验结果（n=3）

3 讨论

多指标综合评价是优化中药复方提取工艺的重要手段，设计正交试验优化提取工艺时，根据影响因素对提取工艺的贡献大小分配不同的权重系数［12-13］。黄芪为方中臣药，而毛蕊异黄酮葡萄糖苷为《中国药典》规定的含量测定成分，给予其30%的权重；覆盆子中鞣花酸类化合物具有抗氧化、抗菌等作用［14］，给予20%的权重；石韦中绿原酸有抗菌、降压等作用［15］，给予20%的权重；同时，浸膏得率也是提取工艺考察的重要指标，故将其权重设为30%。这既保证了数据指标的全面性，又根据各指标的影响程度给予了不同的侧重，保证分析结果合理、科学［16］。

通过查阅文献及多次预试验摸索，本试验中采用双波长切换的方法，实现了同时测定葆肾合剂中3 种有效成分。通过对比不同流动相系统对分离效果的影响，选择了乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液等流动相。结果表明，选择乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱时，所测成分各峰与其他峰有良好的分离度。利用3 种不同品牌的色谱柱Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），YMC-Pack ODS-A C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对3 种成分进行了含量测定，分离度较好。经方法学考察证实，该方法可达到有效成分分离测定的要求，且准确、可靠。

在葆肾合剂提取工艺的试验研究中，充分考虑了君臣佐使的配伍原则、主要成分的化学性质及规模化生产的要求，采用多指标综合评分法，优选最佳提取工艺，并进行了验证，避免了单一因素对中药复方提取影响的局限性和片面性。