慢粒灵制剂中青黛定性鉴别和红花3 种黄酮类成分含量测定*

贾 勇，赵金秀

（河北省廊坊市中医医院，河北 廊坊 065000）

慢粒灵颗粒由三棱、莪术、青黛、山豆根、桃仁、红花、黄药子7 味中药组方，具有活血化瘀、散结消的作用，临床主要用于治疗瘀血阻滞证慢性粒细胞白血病［1］。方中三棱有消积止痛、破血行气作用［2］；红花有散瘀止痛、活血通经作用，其活血成分为黄酮类成分［3-4］，包括羟基红花黄色素A、山柰素、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和红花黄色素B 等。目前，质量标准中仅见青黛和山豆根的薄层色谱鉴别。青黛和山豆根主要是发挥清热解毒、消肿利咽的作用［5］。青黛中的靛玉红有治疗慢性粒细胞白血病作用［6］，且根据中药质量标志物基于性-效-药（Q-Marker）的概念［7-8］，中药质量标志物主要是指能与中药功能密切相关的成分，可作为反映中药安全性和有效性的标志性物质进行质量控制。因此，该质量标准的控制与中药质量标志物的概念关系不紧密，具有一定缺陷。本研究中对处方中青黛采用薄层色谱（TLC）法进行鉴别，采用超高效液相色谱（UPLC）法测定慢粒灵颗粒（胶囊）中羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和红花黄色素B，对其红花药材进行质量控制，可为提高和完善慢粒灵颗粒（胶囊）的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Water ACQUITY H-Class 型超高效液相色谱仪，包括Empower 3 工作站（美国沃特世仪器公司）；Sartorius BT124 型电子天平（北京赛多利斯仪器公司，精度为万分之一）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）；Mili-Q 型超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试药

慢粒灵颗粒（医院制剂室自制，批号分别为20190320，20190706，20180516，规格为每袋15 g）；慢粒灵胶囊（ 医院制剂室自制，批号分别为20190704，20190730，20190801，规格为每粒0.45 g）；羟基红花黄色素A 对照品（批号为111637-201308，含量为96.5%），靛蓝对照品（批号为110716-201612），靛玉红对照品（批号为110717-201805），购自中国食品药品检定研究院；6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷对照品（批号为MUST-19041506，含量99.72%），红花黄色素B 对照品（批号为MUST-19041507，含量99.68%），均购自成都曼斯特公司；乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；三氯甲烷、丙酮、甲苯、三氟乙酸、磷酸二氢铵、磷酸，均为分析纯，均购自上海国药集团化学试剂公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 青黛TLC 鉴别

取3 批慢粒灵颗粒各1 袋，研细，称取粉末各10 g；取胶囊20 粒，研细，分别置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷20 mL，超声处理（功率为350 W，频率为50 kHz）10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取靛蓝、靛玉红对照品，加氯仿制成每1 mL 各含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。再取缺青黛的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照2015 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述4 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5 ∶4 ∶1，V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色 谱 柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脱，0～5.5 min 时2%A～5%A，5.5～8.4 min 时5%A～9%A，8.4～19.8 min 时，9%A～20%A，19.8～22 min 时20%A；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：380 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取羟基红花黄色素A 对照品12.52 mg、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷10.08 mg 和红花黄色素B 9.96 mg，精密称定，置同一25 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。取慢粒灵颗粒（批号为20190320）10 袋，研细；取慢粒灵胶囊20 粒，研细。精密称取上述粉末各1.0 g 置150 mL 具塞锥形瓶中，分别加25% 甲醇50 mL，超声处理（功率为350 W，频率为50 kHz）30 min，取出，放冷，加25%甲醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取慢粒灵颗粒处方量的1 /10，制备缺红花药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备红花阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取上述3 种溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。详见图2。可见，红花阴性样品对3 种成分的测定无干扰。

线性关系考察：取上述对照品贮备溶液作为5 号对照品溶液，分别精密吸取50，100，1 000，2 000 μL，分别置10 mL 容量瓶中，依次作为1～4 号对照品溶液。分别取上述1～5 号对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，以进样量（X，ng）为横坐标、相对应峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

精密度试验：分别精密收取线性关系考察项下的1号、3 号和5 号对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次。结果1 号对照品溶液中羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷、红花黄色素B 峰面积的RSD 分别为1.98%，2.03%，1.65%（n=6）；3 号对照品溶液中羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3-O-β-葡萄糖苷、红花黄色素B 峰面积的RSD 分别为1.37%，1.55%，1.12%（n=6）；5 号对照品中羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷、红花黄 色 素B 峰 面 积 的 RSD 分 别 为0.62% ，1.05% ，0.88%（n=6）。结果表明，仪器精密度良好。

图2 慢粒灵颗粒中3 种黄酮类成分高效液相色谱图

表1 3 种成分线性关系考察结果（ n=3）

稳定性试验：取上述供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，连续考察24 h，记录色谱峰面积。结果羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和红花黄色素B 峰面积的RSD 分别为1.98%，2.32%，2.56%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：取慢粒灵颗粒（批号为20190320），依法制备供试品溶液6 份，按拟订色谱条件分别进样测定。结果羟基红花黄色素A、6-羟基山柰酚-3- Oβ-葡萄糖苷和红花黄色素B 的平均含量分别为6.08，0.66，2.16mg/g，RSD 分别为2.01%，1.52%，1.36%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取羟基红花黄色素A 28.62 mg、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷9.73 mg，精密称定，置同一10 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解稀释至刻度，作为待加溶液1；取红花黄色素B 8.28 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，作为待加溶液2；取已知含量的慢粒灵颗粒6 份，精密称定，每份0.5 g，置具塞锥形瓶中，向上述6 份样品中分别加入上述待加溶液1 和待加溶液2 各1 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

2.2.4 样品含量测定

取3 批慢粒灵颗粒/胶囊，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，结果见表3。

表2 加样回收试验结果（n=6）

表3 慢粒灵颗粒/胶囊中3 种黄酮类成分含量测定结果（mg/g）

3 讨论

3.1 指标成分选择

预试验中，首先采用TLC 法对方中君药莪术和三棱进行薄层鉴别，结果发现二者相同成分较多，阴性成分互相有干扰，通过调整展开剂比例和不同的供试品制备方法均未能排除干扰，因此未将君药列入本研究。方中青黛的主要成分靛玉红具有消炎、抗肿瘤等药理活性，故选择TLC 法进行鉴别控制；红花有活血化瘀、消炎、抗肿瘤的功效，其中以黄酮类成分羟基红花黄色A、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和红花黄色素B 含量较高，因此，选择上述3 种成分为指标成分进行含量测定。

3.2 供试品溶液制备方法选择

首先考察不同提取溶剂（水、25%甲醇、75%甲醇和甲醇）的影响，结果发现甲醇作为提取溶剂时，羟基红花黄色A 和红花黄色素B 的含量下降较大；纯水作为溶剂时，色谱峰杂质较多，6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷峰形拖尾；25%甲醇作为提取溶剂时，3 种成分的含量相对较大，且峰形良好，分离度大于1.5。因此，选择25%甲醇作为提取溶剂。采用三因素三水平（制备方法为回流、超声、索氏提取；超声时间为20，30，40 min；超声功率为150，300，450 W）进行优化时，发现3 种提取方法提取率相差不大，超声功率对其也无明显影响，但随着超声时间的延长，含量逐渐增大，30 min 与40 min 含量接近。因此，确定供试品制备方法为25%甲醇超声（功率为300 W，频率为50 kHz），提取30 min。

3.3 测定条件选择

采用PDA 检测器对3 种成分进行全波长扫描，结果发现于380 nm 波长处3 种成分的干扰较小，峰形对称，分离效果好，故选择380 nm 作为3 种成分含量测定的最佳波长。由于黄酮类化合物易溶于甲醇、乙腈，因此流动相的选择先后采用甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液等多种流动相进行洗脱，结果发现，当乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相时，各色谱峰分离较好，峰形对称。故选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

3.4 方法评价

本研究中建立的TLC 法专属性强，无干扰；UPLC法可同时测定红花中羟基红花黄色A、6-羟基山柰酚-3- O-β-葡萄糖苷和红花黄色素B 3 种黄酮类成分的含量，且具有分析速度快、准确性高、重复性好的优点，可用于慢粒灵颗粒中青黛和红花药材的质量控制，同时为提高慢粒灵颗粒（胶囊）的质量标准提供参考。