冠状支架植入对血管平滑肌细胞力生长因子影响的研究

李天助，卢妮敏，陈柯涵，林英忠，李今朝

(1.右江民族医学院，广西 百色 533000；2.广西壮族自治区人民医院，广西 南宁 530000；3.锦州医科大学附属第一医院心内科，辽宁 锦州 121000)

大量的临床结果表明，PTCA术后有一定比例的支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)现象发生，尤其是术后3～6个月内在再狭窄率曾高达30%[1]。心血管支架置入后引发的支架内再狭窄已经成为PTCA术推广应用中的一个重要问题，人们一直致力于支架再狭窄的研究。

目前研究表明，支架术后再狭窄的主要因素包括：病变的特点、患者自身状况、支架本身的特性、术者的手术操作行为、术后药物的应用等情况。而支架术后再狭窄的生理基础是内皮的增生和平滑肌细胞的正性重构。而支架或球囊扩张，引发的血管平滑肌牵张和牵张后的平滑肌过度增生，是冠状动脉正性重构和冠脉支架术后再狭窄的重要机制。因此，对机械牵张后引发的冠脉血管平滑肌细胞基因表达，和平滑肌细胞的超微结构变化，的研究对防治支架再狭窄的发生有着十分重要的意义。

力生长因子(mechano growth factor，MGF)是一种IGF-1变体，由Igf-1基因剪接变异产生，其特征是比IGF-1的羧基端多出延伸肽(extention peptide，E肽)，研究发现MGF是力学敏感因子。表达量受到拉伸刺激的调控。进一步研究发现，MGF能激活卫星细胞、促进成肌细胞增殖，参与损伤肌肉组织的修复与再生；在心肌梗死的治疗中，能降低永久缺血损伤面积和增加存活面积；在修复神经损伤与维持骨质量和修复骨损伤等方面有重要的作用。而作为MGF作用的重要靶器官的冠脉血管内平滑肌细胞的增生增值一定会受到MGF表达水平的影响。并在机械支架牵张后的平滑肌细胞结构变化中其重要作用，有深入研究的必要。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用Sprague-Dawley(SD)犬(来源于辽宁医学院动物实验中心)，雄性，体重21.6～24.7 kg，于实验条件下饲养1 w。随机分成两组，每组7只，分别命名为支架植入组(于冠状动脉内植入不锈钢材料支架)、对照组(与支架植入组完全相同的操作过程，只是不对冠状动脉植入支架)。

1.2 检测指标及方法

1.2.1 冠状动脉造影

应用德国西门子公司DTA造影机进行冠状动脉造影，造影前4 h给予阿斯匹林片100 mg口服，波立维片75 mg口服，建立静脉通路，严格无菌操作，碘伏消毒股动脉穿刺部位，行右股动脉剖开术，暴露右股动脉并穿刺，植入6F鞘管，鞘肝素2000单位，应用多功能造影导管行左冠状动脉造影。

1.2.2 冠状动脉支架植入

在造影完成后补肝素至4000单位，延造影导管送入BMW导丝至前降支远端，送入支架3 mm×16 mm以20 atm释放，造成过度牵拉植入模型(suoshik模型)。术后给予口服阿斯匹林片100毫克/日，口服波立维片75毫克/日，口服立普妥20毫克 /日。术后6 h给予每日2次皮下注射低分子肝素钙0.4单位。造影结束结扎股动脉，缝合包扎。

1.2.3 血液中MGF、VEGF水平检测：

于术前、术后48 h和术后1个月采动物静脉血，2000 rpm离心，取上清液，应用博士德公司TNF检查酶联免疫检测试剂盒，按说明书进行相关检测。

1.2.4 冠脉血管平滑肌细胞中MGFmRNA表达检测

于支架植入后1个月行股动脉抛开放血法处死动物，开胸，暴露心脏，于主动脉弓处离断心脏血管，应用生理盐水灌注冠状动脉前降支，待无血液后，灌注5%福尔马林液固定。石蜡包埋，检测前脱蜡，应用武汉博士德公司的TNF原位杂交试剂盒，应用原位杂交法检测冠状动脉支架植入部位的MGFmRNA的表达，mRNA表达检测免疫组化试剂盒(SANTA公司)说明进行操作。对图片进行半定量分析(在200～400倍显微镜下，计算上、中、下、左、右5个视野阳性着色，用平均灰度代表阳性表达，灰度值测定的是透光度0～250之间，灰度值越高表达越弱。

1.2.5 MGF蛋白水平检测

应用Westernblot法检测蛋白水平。裂解细胞提取细胞总蛋白，MGF蛋白测定试剂盒(北京威盛生物制品公司)测定蛋白浓度后，取50 μg样品蛋白进行12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酞胺(SDS-PAGE)凝胶变性电泳，然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入小鼠抗人Fas单克隆抗体(Sigma公司)，37 ℃，l h，洗涤后加扫描图像，用随机附带软件Odyssey 1.1计算强度。实验重复3次。

1.2.6 支架植入后内皮细胞和平滑肌细胞的线粒体和内质网超微结构的电镜观测

(1)取材：根据实验目的取材，要求部位准确，体积小于2 mm；(2)醛类固定：用2%～3%的戊二醛固定2 h；(3)清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min；(4)锇酸固定：用1%～2%的锇酸固定2～3 h；(5)清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min；(6)脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15 min，再用100%乙醇脱水3次，每次30 min；(7)置换：用环氧丙烷或丙酮置换3次，每次30 min；(8)浸渍：10 h以上，浸渍过程如下：丙酮，包埋剂=3∶1的浸渍液浸渍(动物样品1 h，植物样品2～3 h)；丙酮，包埋剂=1∶1的浸渍液浸渍(动物样品1 h，植物样品2～3 h)；丙酮，包埋剂=1∶3的浸渍液浸渍(动物样品4 h，植物样品12～24 h)；纯包埋剂浸渍(动物样品4 h，植物样品12～24 h)；(9)包埋：将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中；包埋剂配方中Epon812MNA，DDSA，DMP-30的比例；(10)聚合：将包埋板置于40 ℃、60 ℃条件下各聚合48 h；修块：将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2 mm×0.2 mm；超薄切片：切片厚度50～90 nm；染色：铀染色5～15 min清洗铅染色5～10 min清洗；3名病理科医生背对背观测。

1.2.7 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，两组间行t检验。

2 实验结果

2.1 支架植入即刻造影结果

冠状动脉介入治疗后即刻造影结果显示各组动物支架植入顺利无狭窄及撕裂，timi血流3级，见图1、2、3。

图1 冠状动脉支架植入图2 冠状动脉支架植入图3 冠状动脉支架植入

2.2 支架植入1个月后冠状动脉内膜病理组织学检测

1个月后处死动物光镜下可见：不锈钢支架植入组冠脉血管发生显著的内膜增生、腔内血栓形成并伴有平滑肌增生。对照组无上述变化，见图4、5。

图4 1个月后对照组无明显异常所见 图5 支架植入组，冠状动脉血管内皮和平滑肌明显增生

2.3 支架植入后1个月冠状动脉血管电镜检测

支架植入后1个月对各组冠状动脉行电镜检测发现：对照组内皮细胞形态良好，无明显细胞器的肿大，线粒体，内质网结构良好；支架植入组后却表现为：内皮细胞增生不良、细胞器结构紊乱、线粒体、内质网结构解体，见图6、7、8。

2.4 1个月后支架植入部位炎细胞浸润情况

支架植入组，植入部位明显炎细胞浸润，对照组无明显炎细胞浸，见图9、10、11、12。

图6 对照组冠状动脉内皮和平滑肌电镜检测

图9 对照组100倍 图10 支架植入组100倍

图11 对照组200倍 图12 支架植入组200倍

2.5 血液中MGF水平比较

血液中MGF水平比较，见表1。

表1 术前术后血液中MGF水平比较

2.6 支架植入1个月后平滑肌细胞MGF的mRNA表达水平

支架植入组MGF的mRNA表达明显高对照组，见表2、图13、14。

表2 支架植入组和对照组MGF的mRNA基因表达水平

图13 对照组 图14 支架组

2.7 1个月后平滑肌细胞MGF的蛋白表达

免疫印迹结果可以看到，支架置入组平滑肌细胞中MGF蛋白的表达水平(99.93±16.77)明显高于对照组(31.63±9.86)有统计学差异(t=8.730，P<0.01)，见图15。

图15 支架组及对照组平滑肌细胞MGF蛋白免疫印迹

表3 平滑肌细胞MGF蛋白表达水平

3 讨 论

随着生活方式的改变，人类患病普也在发生着巨大的改变。冠心病已经成为首要的疾病，取代肿瘤成为第一位的疾病。冠心病心肌梗死则成为了威胁人类生命的首位杀手。冠心病的防治已迫在眉睫。冠心病是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称，其病理基础是冠状动脉的粥样硬化，由于巨噬细胞吞噬了大量的脂质物质在冠状动脉内皮下形成粥样物质的沉积，粥样物外面包裹着纤维组织帽。由于斑块的存在造成官腔的狭窄，引发其支配的心肌处于缺血状态，并使得冠状动脉储备减低，最终导致心肌细胞缺血，引起活动后胸痛和心肌疾病的发生。如果斑块破裂将导致急性血管闭塞，引发急性心肌梗死，危及患者生命。

随着生活方式的改变，人类患病普也在发生着巨大的改变.由原来的传染性疾病，向营养性疾病改变。高血压、冠心病、糖尿病等代谢性疾病的发病率正逐年增高。其中冠心病已经成为首要的疾病，在疾病的发病中取代肿瘤成为第一位的疾病。冠心病心肌梗死则成为了威胁人类生命的首位杀手，冠心病的防治已迫在眉睫。冠心病是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称，其病理基础是冠状动脉的粥样硬化，由于巨噬细胞吞噬了大量的脂质物质在冠状动脉内皮下形成粥样物质的沉积，粥样物外面包裹着纤维组织帽。由于斑块的存在造成官腔的狭窄，引发其支配的心肌处于缺血状态，并使得冠状动脉储备减低，最终导致心肌细胞缺血，引起活动后胸痛和心肌疾病的发生。如果斑块破裂将导致急性血管闭塞，引发急性心肌梗死，危及患者生命。目前冠心病心肌梗死已经成为威胁人类生命的首要杀手。

药物治疗不能使已经形成的斑块消失。因此，对斑块的人为干预成为治疗冠心病的有效手段。在对冠脉板块的干预手段中又以经皮穿刺冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)最为常见。现在全世界每年约有1500万名心血管病患者需要接受先进的经皮穿刺冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)[1]1767-1780，其中约80%在患者置入了心血管支架。由于PTCA具有微创伤、高效性等优点，在狭窄心血管内置入支架已成为心肌血运重建的主要手段，并迅速发展成为目前治疗心血管狭窄引发冠心病的一种有效方法。

但大量的临床结果表明，PTCA术后有一定比例的支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)现象发生，尤其是术后3～6个月内在再狭窄率曾高达30%[2]。心血管支架置入后引发的支架内再狭窄已经成为PTCA术推广应用中的一个重要问题，人们一直致力于从根本上解决这一问题。研究人员对ISR发生机制的不断深入研究表明，支架置入后造成的血管壁损伤引发的动脉平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)过度增殖、迁移和变性，以及支架附近的血栓形成是导致ISR发生的两个主要原因[3]。研究结果表明，冠动脉血管损伤后，受损内膜下的物质暴露于血液中，导致血小板的激活；血小板通过释放凝血酶激活更多的血小板，引发生长因子的释放，促使细胞间成分发生改变，介导VSCM过度增殖并由中膜向内膜迁移。VSCM发生表型的改变，从具有收缩功能的细胞分化成具有分泌功能的细胞，分泌细胞外基质，从而形成新生内膜，导致血管的内膜变厚。在此过程中，过多的血小板还启动了凝血机制而形成血栓。以上这些因素共同导致支架内VSMC的过度增殖、迁移、变性以及血栓的形成，最终引发支架内再狭窄的发生[4-5]。

为了能够有效降低心血管支架内再狭窄的发生率，许多研究都集中在对支架进行表面改性处理方面，包括：药物涂层[6-7]、内皮化处理[8-9]、基因涂层[10-11]和放射化处理[12]等，但是，每种方法均还存在一定的弊端。因此，人们仍迫切需要一种性能安全可靠和稳定持久，并能有效抑制支架内再狭窄的新型心血管支架。

但是无论什么材料的支架，都需要进行释放扩张，将对冠脉血管产生不可避免的牵张，作为机械性损伤必然会带来局部的炎症反应和相应内皮细胞特别是平滑肌细胞的增生，引发血管的正性重构，是引发支架植入术再狭窄的最根本一环，而目前医学界把解决再狭窄的重点，都放到了解决支架的材料学上，而忽视了机械牵张对血管平滑肌结构和相关基因表达的影响。因此，对支架植入的机械牵张再平滑肌结构和基因表达上的影响进行深入的研究，很有必要，可能成为解决支架再狭窄的关键环节。

力生长因子(mechano growth factor，MGF)是一种IGF-1变体，由Igf-1基因剪接变异产生，其特征是比IGF-1的羧基端多出延伸肽(extention peptide，E肽)，研究发现MGF是力学敏感因子。表达量受到拉伸刺激的调控。进一步研究发现，MGF能激活卫星细胞、促进成肌细胞增殖，参与损伤肌肉组织的修复与再生；在心肌梗死的治疗中，能降低永久缺血损伤面积和增加存活面积；在修复神经损伤与维持骨质量和修复骨损伤等方面有重要的作用。而作为MGF作用的重要靶器官的冠脉血管内平滑肌细胞的增生增值一定会受到MGF表达水平的影响。并在机械支架牵张后的平滑肌细胞结构变化中起重要作用，有深入研究的必要。