氧化石墨烯-海藻酸钠-壳聚糖复合支架的制备及表征

王博蔚，马 瑞，吴 凡，刘志辉，李凌锋，张 骁，刘定坤，杨 楠，李美慧，杨德峰，孙 琪

（1.吉林大学第二医院,长春130021；2.吉林大学口腔医院,长春130041）

肿瘤、外伤及感染等问题造成的骨组织大面积缺损严重影响着患者的身心健康，对临床骨重建提出了巨大挑战. 作为传统修复骨缺损“黄金标准”的自体骨移植技术因供体部位有限及造成患者二次创伤等缺点而应用受限［1～3］. 近年来，骨组织工程技术的兴起为骨缺损的修复带来了希望. 该技术通过将具有适当机械性能的可降解生物支架材料植入骨缺损部位，作为类似天然细胞外基质的临时模板，来促进间充质细胞的黏附、增殖及成骨分化直到产生新生骨基质［4］. 支架材料作为骨工程技术的核心，应具有良好的机械性能、降解性能、适宜的孔隙结构和孔隙率及优异的生物相容性［5～8］.

海藻酸钠（SA）为阴离子型天然高分子多糖，易溶于水［9］，在室温下，将二价阳离子（如Ca2+）添加入SA水溶液中，会形成稳定的凝胶［10］；另外，SA还具有良好的生物相容性、可生物降解性及亲水性，因此在医学领域应用广泛，如被用于药物及生长因子的递送、细胞包封及组织工程等［11，12］. 壳聚糖（CS）作为几丁质的脱乙酰基衍生物，是阳离子性质的天然多糖［13］. 其多糖结构与骨和软骨细胞外基质的葡萄氨基葡聚糖结构具有相似性，可以加速细胞的分化和成熟［14］；并且CS还具有加速伤口愈合、抗菌和促进骨骼再生的作用，因此被用于骨组织工程［15，16］. 但CS 和SA 强度不足及降解速率过快等缺陷限制了其发展.

氧化石墨烯（GO）是石墨烯的衍生物，具有高比表面积及高机械性能等优点. 其基本结构是二维单层碳原子结构，表面含有大量羟基、羧基及环氧基等含氧官能团［17］，这些基团的存在赋予了GO通过静电相互作用、氢键、π-π共轭作用与生物活性分子或其它材料结合构建复合支架材料的可能性，进而提高复合支架材料的生物相容性及机械性能［18，19］. Purohit 等［20］将GO加入到海藻酸钠-明胶支架中，不仅增加了支架的机械性能，同时检测到细胞的黏附和增殖得到明显的改善，使得GO在骨组织工程领域被广泛研究.

目前，关于将GO与生物相容性好的SA和CS复合的研究报道仍较少. 本文利用冷冻干燥技术将不同量的GO与SA和CS复合，研究了GO的含量对（质量分数0，0.3%，0.5%，0.7%，1%）支架材料理化性能的影响，并得出最佳GO含量，为后续实验及应用奠定基础.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

海藻酸钠，黏度为4～12 mPa∙s，美国Sigma 公司；壳聚糖，脱乙酰度为80.0%～95.0%，黏度为50～800 mPa∙s，国药化学集团化学试剂有限公司；氧化石墨烯，南京先丰纳米材料有限公司；无水氯化钙（CaCl2）、冰醋酸和溴化钾（KBr），分析纯，北京化工厂；磷酸盐缓冲溶液（PBS），美国Hyclone 公司；C6005型CCK-8试剂，新赛美生物科技公司.

Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱（FTIR）仪，美国Thermo公司；酶标仪，美国Bio-TEK公司；AGXplus系列台式电子万能试验机，日本Shimadzu公司；JE0L-6700F型扫描电子显微镜（SEM），日本电子公司；ALPHA1-2LD型冷冻干燥机，德国Marin Christ公司；AL204型电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SPX-150BE型恒温细胞培养箱，美国Thermo公司.

1.2 实验过程

1.2.1 支架的制备 在搅拌条件下，将2 g SA粉末分次溶于100 mL去离子水中，以1000 r/min的速率搅拌2 h，得到SA储备溶液，置于4 ℃冰箱备用.

在搅拌条件下，将2 g CS粉末分次溶于100 mL 0.5 mol/L的冰醋酸水溶液中，以1000 r/min的速率搅拌2 h，得到CS储备溶液，置于4 ℃冰箱备用.

在搅拌条件下，将0.1 g GO 粉末溶于100 mL去离子水中，以500 r/min 的速率搅拌1 h后，超声振荡分散2 h，置于4 ℃冰箱备用.

按照m（SA）∶m（CS）=1∶1 的比例，在搅拌条件下，用注射器分次抽取SA 溶液缓慢滴加到CS 溶液中，以1000 r/min速率于室温下连续搅拌4 h，置于4 ℃冰箱中备用.

将一定体积的GO 溶液加入到SA-CS 混合溶液中，以1000 r/min 的速率搅拌24 h，分别制备出GO含量（质量分数）为0，0.3%，0.5%，0.7%，1%的混合溶液，恒温下高速搅拌12 h.

将上述混合溶液放入24孔板，于−20 ℃下冷冻24 h，再于−80 ℃冷冻干燥. 将冷冻干燥后的支架在20 mL质量分数为2%的CaCl2溶液中浸泡1 h，然后用20 mL去离子水冲洗3次，再次冷冻干燥. 以制得的SA-CS 支架作为空白组，GO 质量分数分别为0.3%，0.5%，0.7%，1%的GO-SA-CS 支架作为实验组，样品分别标记为0.3GO，0.5GO，0.7GO和1GO.

1.2.2 溶胀比的测定 将各组支架称重，记为m0，然后充分浸入等量去离子水中，2 h后取出，用滤纸轻轻吸干支架表面水分，再次称重，记为m1. 每组样品做3 个平行样，利用下式计算溶胀率（Swelling ratio，%）：

1.2.3 孔隙率的测定 将装满无水乙醇的比重瓶称重，记为m′，将称重为m0的干燥支架放入比重瓶内，超声振荡，无明显气泡后再次加满无水乙醇，称重，记为m2；将浸有无水乙醇的支架取出，称重比重瓶和剩余无水乙醇的重量，记为m3；每组样品做3 个平行样，根据下式计算支架孔隙率（Porosity ratio，%）：

1.2.4 支架体外降解检测 将各组支架称重，记为m0，分别置于等量PBS溶液中完全浸泡，于37 ℃恒温箱内培养，分别于3，6，9，12，15，18，21 d后取出，用等量去离子水反复冲洗3次，再次冷冻干燥，称重，记为m4. 每组做3个平行样，通过下式计算支架的质量损失分数（Mass loss，%）：

1.2.5 力学性能的测定 将各组支架制备成直径10 mm、高10 mm的圆柱体，在测试温度为23 ℃，恒应变速度为0.60 mm/min条件下，利用电子万能试验机测试支架的弹性模量.

1.2.6 体外细胞毒性实验 将各组支架消毒灭菌处理后，置于24 孔板中，各加入2 mL 完全细胞培养液［DMEM 培养基，含胎牛血清10%（质量分数），链霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL］，置于37 ℃，5%CO2细胞培育箱中孵育24 h 后，吸取浸提液分别用细菌滤器过滤，制得用于细胞培养的支架浸提液.

小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）由吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室提供，调整细胞（第三代）密度为5×103Cell/孔，接种到96孔板中，用倒置显微镜观察孔板底部细胞密度>90%时，吸弃原培养基，用完全细胞培养液冲洗2次后更换各组支架浸提液100 μL/孔，实验分为3组：实验组（各组支架浸提液接种细胞）、阴性对照组（细胞培养基接种细胞）和空白组（单纯细胞培养基，无细胞），每组各设3个复孔，继续置于细胞培养箱中孵育，在培养24，48，72 h后取出. 吸弃原培养基，用完全细胞培养液冲洗1次，按照CCK-8试剂盒操作说明，向每孔加入10 μL CCK-8溶液及100 μL细胞培养液，继续放入细胞孵育箱培育2 h后取出，利用酶标仪在波长450 nm条件下读取吸光度值（OD），通过下式计算细胞存活率，并根据根据国家体外细胞毒性分级标准（GB/T16886.5-2003，如表1示，0级和1级代表支架材料无明显细胞毒性，2～4级代表支架材料细胞毒性依次增加）对各组支架细胞毒性进行评级：

式中，下角标exp.，blank和nc分别代表实验组、空白组和阴性对照组.

Table 1 Toxicity classification criteria and toxicity evaluation results

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图1 为各组支架的傅里叶变换红外光谱图. 在SA 的谱线中，3427 cm−1附近的宽峰归属为—OH伸缩振动峰，1606 cm−1处为C=O 特征峰［21］；在CS 的谱线中，3650～3000 cm−1范围内的吸收带归属为—OH的伸缩振动，3427 cm−1附近较宽的吸收峰归属为—OH 伸缩振动吸收峰与—NH 的伸缩振动吸收峰重叠而增宽的多重吸收峰，1649 和1595 cm−1处分别为酰胺Ⅰ中C=O 的伸缩振动吸收峰和酰胺Ⅱ中的N—H的弯曲振动吸收峰；在SA-CS的谱线中，1649 和1595 cm−1处的收峰移动到1619 cm−1处，说明SA和CS通过静电作用相互结合，且光谱中3448 cm−1处的特征峰归属为—OH 的伸缩振动；在0.3GO，0.5GO，0.7GO 和1GO 支架的谱线中，—OH 的特征峰分别出现在3439，3430，3423和3417 cm−1处，与SA-AC 相比，峰位向低波数移动. 氢键可使基团化学键力常数减小，导致分子跃迁振动所需的能量变小，在红外光谱图上表现为伸缩振动波数降低. 而GO 表面富含的—OH，—COOH 和—C=O 含氧基团可与CS 中的—NH2，—OH 及SA 所含的—OH 和—COOH 之间形成氢键，因此导致—OH的伸缩振动特征峰红移.

Fig.1 FTIR spectra of SA(a), CS(b), SA⁃CS(c),0.3GO(d),0.5GO(e),0.7GO(f)and 1GO(g)

2.2 支架的宏观外形及微观结构

图2为支架材料的宏观图片. 可见，支架材料在室温下呈固态海绵状，SA-CS组支架呈白色，加入GO后颜色加深；具有一定的可塑性，与冷冻干燥过程中所用容器形状相符（以24孔板为例），因此可根据需要制备成与所用容器相符的形状.

Fig.2 Photographs of SA⁃CS(A),0.3GO(B),0.5GO(C),0.7GO(D)and 1GO(E)

图3 为各组支架的SEM 照片. 可见，支架内部均为三维网状互通结构，该结构可为细胞的黏附、增殖、分化进而形成新生骨基质提供空间［22］；随着GO 的加入及含量的增加，支架内部的孔径逐渐减小，结构也更加致密. 通过Nano Measure 软件分析每组支架的平均孔径大小，算得支架SA-CS，0.3GO，0.5GO，0.7GO 和1GO 的孔径依次为（217.14±19.74），（163.73±17.65），（162.48±24.39），（160.43±1.12）和（151.89±8.41）μm，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）. 已有研究表明，孔隙是由支架内部冰晶在冷冻干燥过程中升华而形成的，而孔隙的尺寸由冰晶大小决定［23］. 加入的GO可以与SA和CS形成交联，GO含量越高，交联越充分，支架结构也更加紧密，故限制了水分子的自由进入，使冰晶形成受阻，孔径尺寸也随之降低. 由图4可见，随着GO的加入和含量的增加，支架的孔壁厚度增加，SA-CS 支架的孔壁厚度约为0.134 μm，而当GO 质量分数为1%时，支架的孔壁厚度高达0.691 μm. 支架内部孔壁的厚度与支架的机械性能是密切相关的，在植入骨缺损区后可防止结构的坍塌.

Fig.3 SEM images of SA⁃CS(A),0.3GO(B),0.5GO(C),0.7GO(D)and 1GO(E)

Fig.4 SEM images showing the wall thickness of SA⁃CS(A), 0.3GO(B), 0.5GO(C),0.7GO(D)and 1GO(E)

2.3 支架的溶胀比

溶胀比是衡量支架材料亲水性的一个重要指征，适宜的溶胀比有利于营养物质的输送. 图5示出了各组支架的溶胀比结果：SA-CS 组溶胀比最高，达到（1200.81±48.63）%；随着支架中GO 含量的增加，溶胀比逐渐减小，0.3GO，0.5GO，0.7GO 和1GO 的溶胀比分别为（1067.38±8.27）%，（1051.30±10.16）%，（953.61±40.15）%，（939.73±21.85）%，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）. 原因可能是：随着GO含量增加，其与CS和SA形成更充分的物理交联，反应更加完全；同时引入后的GO也作为一种纳米增强相，使复合支架的结构更加致密，阻止了水分子的进入，溶胀能力因此随之下降.但对于骨组织工程支架，过高的溶胀比意味着过量的水分进入支架内部，不仅会对支架产生由内向外的压力，使其孔径增大，结构崩塌，机械强度降低，降解速率加快，还会对初期黏附于支架表面的细胞产生“冲刷”作用，造成黏附细胞的脱落，进而影响骨组织的新生［24］. 所以，GO的加入在适当降低支架溶胀比的情况下又保存了支架的亲水性，仍然使支架材料具有保存体液及向细胞运输营养物质的作用.

Fig.5 Swelling ratios of the scaffolds

Fig.6 Porosities of the scaffolds

2.4 支架的孔隙率

适宜的孔隙率是促进营养物质和细胞迁移、生长及代谢产物排泄的前提［25］. 如图6所示，GO的加入及含量的增加对支架孔隙率无明显影响，SA-CS支架组孔隙率为（84.40±3.70）%，随着GO的加入及含量增加，孔隙率逐渐下降，分别为（78.40±1.84）%，（77.43±1.72）%，（76.59±1.96）%，（73.76±1.72）%，组间比较差异不具有统计学意义（P<0.05）.

2.5 支架的体外降解

理想的骨支架材料的降解速率应与骨组织的新生速率相匹配，给予组织新生充足的时间和空间［26］. 由图7 可见，各组支架体外降解曲线均呈线性，体外降解第21 d，对照组支架的降解率高达64.41%，而实验组支架随GO 含量增加降解率依次为47.90%，41.56%，38.54%和36.19%. 说明GO的加入在很大程度上降低了复合支架的降解速率，且GO 的含量越高，支架的降解速率越慢. 这是由于GO 的加入以及含量的增加限制了过量水分子的进入，进而延缓了支架的降解速率.

2.6 支架的机械性能

优异的机械性能对骨组织工程支架材料至关重要，是其承受周围应力和起支撑作用的保障. 而机械强度又与分子键的结合强度、键合方式、化学成分、支架微观结构及孔隙率有关，是一个综合的考量.

图8示出了各组支架的机械性能. SA-CS支架弹性模量为（1.27±0.01）MPa；当GO的质量分数为0.3%和0.5%时，弹性模量分别增加到（1.39±0.04）和（1.62±0.02）MPa，而当GO 的质量分数增加到0.7%和1%时，弹性模量又进一步增加，分别为（1.81±0.02）和（1.97±0.02）MPa. 这可能归因于GO表面的含氧官能团与SA和CS之间形成的化学键，随着GO浓度的增加，分子量的增加和分子间作用力的增强使得支架更加紧密，机械性能也随之增强［27］；同时，结合SEM观察结果，GO的加入会使支架孔壁厚度增加，也会使得支架机械强度增大.

Fig.7 Plots of mass loss of scaffolds

Fig.8 Elastic modulus of the scaffolds

Fig.9 In vitro cytotoxicity of the scaffold

2.7 支架的体外细胞毒性

支架材料植入体内的首要前提是具有良好的生物相容性，不产生细胞毒性. 图9示出了不同GO含量支架的体外细胞毒性结果. 在培养24，48 和72 h 后，对照组细胞存活率都大于90%，说明SA 和CS具有良好的生物相容性；而当支架中加入GO之后，细胞存活率表现出对GO含量的依赖性，培养72 h后，当GO含量为0.3%时，细胞存活率为129%，明显高于对照组，而当GO浓度升高至0.5%，0.7%和1%时，细胞存活率却分别衰减到65%，63%和50%；这可能是由于GO表面富含的含氧官能团赋予其亲水性，所以适宜含量的GO可以对细胞的生长起到一定的促进作用；但高含量的GO却会引起高强度的氧化应激，干扰细胞代谢，同时氧化区域破坏细胞膜磷脂，进而造成细胞死亡［28］.

在培养72 h之后，随着GO的含量的递增，支架的细胞毒性等级依次为0，0，2，2和2. 说明当支架中GO含量为0.3%时，细胞存活率率达到最优，支架材料具有最佳的生物相容性.

3 结 论

理想的骨支架材料首先在物理性能上应具有合适的孔径和孔隙率、适宜的溶胀比、出色的机械性能和可控的降解速率;其次,在生物性能上要有优异的生物相容性;前者是基础,后者为关键.本实验利用冷冻干燥技术制备了含有不同质量分数的氧化石墨烯−海藻酸钠−壳聚糖复合支架材料.实验结果表明,与海藻酸钠−壳聚糖空白组支架相比,氧化石墨烯加入后的复合支架材料在溶胀比、降解速率和机械性能方面均展现一定的优势,且该优势随着氧化石墨烯含量的升高愈加显著;但体外细胞毒性结果显示,当氧化石墨烯质量分数逐渐升高时,细胞毒性却逐渐增加,造成细胞数目逐渐减少,当氧化石墨烯质量分数为0.3%时,细胞存活率高于空白组,达129%.综合支架物理及生物学性能结果,当氧化石墨烯质量分数为0.3%时支架材料性能达到最优,符合骨组织工程支架材料的基本要求.本文研究结果表明,以氧化石墨烯−海藻酸钠−壳聚糖为原料构建的复合支架可以在保留支架良好生物学性能的基础上进一步改善支架的机械性能,为GO在骨组织工程材料中的应用和开发中提供了新思路.