板蓝根颗粒中水溶性成分HPLC 指纹图谱研究

崔 晓，李 欠，杨 兰，邱黛玉*

（1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州730070；3.甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室，甘肃兰州730070；4.青岛市中心医院药剂科，山东青岛266000）

板蓝根颗粒收载于2015年版《中国药典》一部中，是由板蓝根煎煮醇沉后制成的单方中成药，具有清热解毒、凉血利咽的作用。现行版《中国药典》仅在鉴别项下以精氨酸、亮氨酸为对照采用薄层色谱法进行鉴别[1]。现代药理学研究发现，板蓝根中的水溶性核苷类成分和（R,S）-告依春具有抗病毒的作用，可能是板蓝根中的主要有效成分[2]，因此单纯进行氨基酸薄层色谱法比对无法准确反映出板蓝根颗粒的质量。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。HPLC 指纹图谱因其操作简便、适应性强、所含信息丰富等优点，被广泛用于中药饮片及其制剂的质量控制中[3-7]。本文建立了板蓝根颗粒中水溶性成分HPLC 指纹图谱，旨在为板蓝根颗粒的质控标准提升提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 液相色谱柱（100×4.6 mm，5 μm）；CP255D 型电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；AX124ZH 型电子分析天平（万分之一，奥豪斯仪器常州有限公司）；Direct-Q 型纯水机（美国Millipore 公司）；SCQ-7207C数控功率可调加热超声波清洗机（上海声彦超声波仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品

腺苷对照品（批号Z23S7J21814；纯度≥99%）、尿苷对照品（批号TM0313XA13；纯度≥99.8%）、鸟苷对照品（批号AJ0609NA14；纯度≥98.8%）、胞苷对照品（批号T16J7X9000；纯度≥99.8%）、（R,S）-告依春对照品（批号Y17N9H75488；纯度≥99.9%）、腺嘌呤对照品（批号T14N9Y74844；纯度≥99.9%）均购自上海源叶生物科技有限公司。

表1 待测样品信息

甲醇为色谱纯，水为实验室自制超纯水。

1.3 样品来源

试验所用10 批市售板蓝根颗粒均购自各药品零售企业，样品信息详见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的确定

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 液相色谱柱（100×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），洗脱梯度如表2 所示；检测器波长254 nm，柱温15℃，进样量20 μL，流量1 ml/min，采集时间40 min。

表2 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液制备

精密称取胞苷、尿苷、腺嘌呤、（R,S）-告依春、鸟苷、腺苷对照品适量，分别置于容量瓶中，加超纯水稀释至刻度线，混合均匀，定容至浓度为0.005 mg/ml 作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取板蓝根颗粒适量，研细，称取板蓝根颗粒粉末约1 g（无糖型3 g 装称取约0.6 g）置于100 ml 锥形瓶中，精密量取超纯水50 ml，称定重量，盖硅胶塞，超声处理（400 W，40 KHz）5 min，放冷后称量，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜即得。

2.4 中药指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取1.3 项下同一供试品（S7），按2.3 项下方法制备供试品溶液，使用2.1 项下色谱条件连续进样6 次，以腺苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）。结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）均不大于3%，表明该仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取1.3 项下同一供试品（S7），按2.3 项下方法平行制备6 份供试品溶液，使用2.1项下色谱条件分别进样，以腺苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）。结果：各共有峰的相对保留时间的相对标准偏差（RSD）均不大于3%；相对峰面积的相对标准偏差（RSD）均不大于5%。表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取1.3 项下同一供试品（S7），按2.3 项下方法制备供试品溶液，使用2.1 项下色谱条件分别在供试品溶液制备后0 h、2 h、6 h、10 h、24 h进样，以腺苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）。结果：各共有峰的相对保留时间的相对标准偏差（RSD）均不大于3%；相对峰面积的相对标准偏差（RSD）均不大于5%。表明供试品溶液在室温下存放24 h 内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

取收集的10 批板蓝根颗粒供试品，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样记录色谱图。将所得色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本），以S7 样品作为参照，时间窗宽度设定为0.2 s，采用中位数法对色谱图进行多点校正生成对照图谱，见图1、图2。

2.6 参比峰的选择和相对峰面积、相对保留时间的计算

共确定了9 个共有峰，通过与对照品进行比对，确定1号峰为胞苷、2号峰为尿苷、4号峰为腺嘌呤、5号峰为（R,S）-告依春、6号峰为鸟苷、7号峰为腺苷。7号峰（腺苷）分离度高、峰面积最大、峰位适中，因此选择7号峰作为参比峰，分别计算其他共有峰与参比峰腺苷的相对峰面积和相对保留时间，结果见表3、表4。

2.7 相似度评价

通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本）对10 批板蓝根颗粒的指纹图谱进行相似度计算，结果见表5。不同厂家、不同批次板蓝根颗粒的相似度均≥0.954，表明不同厂家、不同批次的板蓝根颗粒指纹图谱相似度良好，且含糖颗粒与无糖颗粒指纹图谱无明显差异。

3 讨论与结论

板蓝根颗粒在制备过程中采用水煎煮法提取，采用超纯水作为溶剂可以完全反映出板蓝根颗粒中所含成分的情况。试验对分析时间进行了考察，将供试品溶液注入高效液相色谱仪运行2 h，发现40 min后无明显色谱峰出现，因此设定采集时间为40 min。

表3 板蓝根颗粒指纹图谱中共有峰的相对峰面积

表4 板蓝根颗粒指纹图谱中共有峰的相对保留时间

表5 10 批板蓝根颗粒指纹图谱相似度评价

研究发现，由于不同生产厂家选用药材和制备工艺等因素的不同，板蓝根颗粒中各共有峰的峰面积存在一定差异，因此求得相对标准偏差（RSD）较大，但软件求得的相似度却较高，可能是因为板蓝根颗粒中尿苷、腺苷、（R,S）-告依春峰面积过大。

本试验建立的板蓝根颗粒中水溶性成分HPLC指纹图谱共确定了9 个共有峰，通过与对照品比对，确定了其中6 个共有峰的成分。建立的指纹图谱不受生产厂家、辅料等因素的影响，对含糖颗粒和无糖颗粒均有较好的适用性。因此，该方法简便、可靠、适用性强，可作为板蓝根颗粒质量控制的参考依据。