核纤层蛋白病小鼠模型的研究进展

周 玲,范润哥,李东明,刘 恒,舒 伟,3∗

(1.广西医科大学基础医学院,南宁 530021; 2.广西医科大学第一附属医院皮肤科,南宁 530021;3.桂林医学院生物技术学院,广西 桂林 541100)

核纤层( nuclear lamina ) 是由核纤层蛋白(lamins)组成的网状结构,位于细胞核膜内侧,核纤层蛋白是进化上高度保守的Ⅴ型中间纤维蛋白(intermediate filament protein, IF protein),在维持细胞核的正常结构与功能、染色质定位和基因转录、以及细胞衰老与分化等细胞进程中发挥着重要作用[1]。 在哺乳动物中,lamins 分为A 型和B 型,A型lamins 包括lamin A、lamin C 以及含量较低的亚型A△10、lamin C2,由LMNA基因选择性剪切产生。B 型lamins 包 括lamin B1、 lamin B2, 由LMNB1、LMNB2 基因编码产生。 A 型lamins 一般只在原胚胎形成后分化的细胞中表达,而B 型lamins 表达贯穿整个发育过程[2-3]。

由于细胞内许多不同蛋白质直接或间接与lamins 相互作用,LMNA、LMNB1 和LMNB2 基因发生突变常常造成多种效应。LMNA基因已经发现963 个(www.ncbi.nlm.nih.gov / clinvar/)突变,这些突变与至少15 种被称为 “ 核纤层蛋白病” 的疾病相关,包括常染色体遗传病埃- 德型肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy, EDMD)、 扩张型心肌病( Dilated cardiomyopathy, DCM)、 早老症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome, HGPS)、肢带型肌营养不良症( Limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)等。 以HGPS 为例,由于LMNA基因发生点突变引起外显子11 隐蔽剪切位点(G608G:GGC→GGT)激活,导致核纤层蛋白A 前体(prelamin A)肽链羧基末端50 个氨基酸残基被切除,这个被截短的prelamin A 被称为早老蛋白(progerin)。 progerin 保留了CXXA 结构域,而缺失ZMPSTE 24 酶切位点,导致羧基末端不能被剪切,暴露在外的法尼基半胱氨酸甲酯一直存在。 随着时间的推移,progerin 蓄积会导致一系列细胞缺陷和功能障碍,最终造成细胞和组织器官的衰老[4]。 为了研究由于LMNA基因突变造成的疾病并探寻其中的具体机制,人们构建了多种核纤层蛋白病小鼠模型,本文将对核纤层蛋白病小鼠模型进行综述。

1 LMNA 基因缺失突变小鼠模型

1.1 Lmna-/ -和LmnaGT-/ -小鼠模型

第一个LMNA基因突变小鼠模型是lamin A/ C缺失(Lmna-/-小鼠模型)。Lmna-/-小鼠白色脂肪储存减少、生长迟缓、心律失常和核膜蛋白emerin 分布异常,出生后6 ～8 周龄死亡,Lmna+/-小鼠在4 ～6周龄时显示出中度严重性的心脏功能障碍和心肌细胞损伤。 有趣的是,研究表明Lmna+/-小鼠在12个月龄时表现出严重的心脏异常,与LMNA基因突变引起的DCM 表型相似[5-6]。 Kubben 等[7]通过基因捕获技术构建了一种新的lamin A/ C 缺失小鼠模型(LmnaGT-/-小鼠模型)。LmnaGT-/-小鼠在出生后2～3 周龄死亡。 在Lmna-/-小鼠等模型以及EDMD患者肌肉活检中发现,核膜和DNA 损伤是由骨骼肌成熟过程中的核迁移引起的,并与疾病的严重程度相关。 这些发现暗示机械诱导的DNA 损伤是LMNA基因突变引起骨骼肌疾病的致病因素之一[8]。 研 究 发 现 mTORC1 ( mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)在Lmna-/-小鼠的心肌和骨骼肌组织中上调,用mTOR 抑制剂治疗突变小鼠,能够逆转mTORC1 信号升高,从而引起自噬激活促进progerin 溶解和清除,减轻细胞衰老,挽救心脏和骨骼肌功能,并延长寿命[9]。

1.2 LAO、PLAO 和LCO 小鼠模型

为了证明prelamin A 加工过程的重要性,Coffiner 等[10]构建仅合成lamin A 的转基因小鼠模型(LAO 小鼠模型) 和仅合成prelamin A 的转基因小鼠模型(PLAO 小鼠模型)。 在LmnaLAO/LAO小鼠中lamin A 是直接合成的,而在LmnaPLAO/PLAO小鼠中lamin A 是 通 过 prelamin A 加 工 合 成。 尽 管LmnaLAO/LAO小鼠没有了prelamin A 的加工步骤,但两个突变小鼠模型中成熟lamin A 的水平是相当的。LmnaLAO/LAO小鼠正常、健康,没有任何明显的病理表型,存活时间(>24 个月)与野生型(Wild Type,WT)小鼠相当,然而LmnaLAO/LAO和LmnaPLAO/PLAO小鼠成纤维细胞比Lmna+/+小鼠成纤维细胞有更高的核畸形率,这表明细胞异常与组织病理的严重程度并不一致。 有趣的是,只合成lamin C(LCO 小鼠模型)不合成lamin A 的小鼠也表现为完全健康[11]。这些研究结果表明小鼠中prelamin A 加工是可有可无的,lamin A 和lamin C 功能存在互补,缺乏其中之一并不会引起病理表型,但是同时缺乏lamin A 和lamin C 却是致命的。

2 LMNA 基因错义突变小鼠模型

2.1 Lmna N195 K 和Lmna H222P 小鼠模型

两个携带LMNA基因错义突变的小鼠模型再现了人类疾病的表型:一个是LMNA基因第195 位的天冬酰胺突变为赖氨酸(N195 K 小鼠模型),导致家族性扩张型心肌病伴传导系统疾病( familial dilated cardiomyopathy with conduction systems disease, DCM-CD1)[12]。 另一个是LMNA基因第222 位的组氨酸突变为脯氨酸(H222P 小鼠模型),导致常染色体显性遗传EDMD (autosomal dominant inheritance, AD-EDMD)[13]。 有趣的是,虽然杂合子小鼠没有发现异常,但LmnaN195K/N195K小鼠出现严重心律失常而过早死亡[12]。 与WT 小鼠相比,LmnaN195K/N195K小鼠的心室肌细胞动作电位持续时间 更 长, 晚 期 钠 电 流( Na+) 增 加[14]。 同 样LmnaH222P/H222P小鼠表现出骨骼肌和心肌的营养不良,纯合子小鼠在13 月龄全部死亡[13]。 研究发现LmnaH222P/H222P小鼠心肌中MAPK、JNK、p38α、ERK1 /2、AKT/ mTORC1、TGF-β 信号上调,WNT/ β-catenin信号下调,连接蛋白43(connexin 43, CX43)低表达并且分布改变,微管细胞骨架不稳定导致CX43 重塑, 其 中ERK1 / 2、 AKT/ mTORC1、 TGF-β、 WNT/ βcatenin 信号已经证实与DCM 的发病机制有关,药物阻断这些信号通路以及改变CX43 定位可以改善LmnaH222P/H222P小鼠的左心室功能[15-16]。 研究者正在进一步探索通过联合用药阻断以上信号通路对LMNA基因突变引起的DCM 的治疗效果。

2.2 LmnaM371 K 小鼠模型

人类患EDMD 主要表现为常染色体显性遗传病,为了确定LMNA基因突变是否能以显性方式引起小鼠EDMD 样表型。 Wang 等[17]构建了M371 K转基因小鼠模型( 第371 位甲硫氨酸突变为赖氨酸,导致AD-EDMD)。 杂合子小鼠的出生率明显低于预期,可能是由于突变蛋白影响小鼠早期胚胎发育。 小鼠出生后存活2 ～7 周,表现为心肌细胞胞质嗜酸性粒细胞增多、肌原纤维碎裂、核破裂、核固缩和细胞水肿,病灶多发,无纤维化或明显炎症,提示急性或亚急性心脏损伤。 然而,人类患EDMD 更具有渐进性和扩张性,心脏受累是最严重的并发症,表现为房室传导异常,左心室扩张和室性心律失常,左室为主的心肌细胞破坏随着疾病的进展而加重。 因此,该小鼠模型并没有完全模拟人类患EDMD 的表型,这种差异产生的原因可能是由于M371 K 突变蛋白在该小鼠模型高表达。

2.3 LmnaL530P 小鼠模型

研究者在一例常染色体显性EDMD 患者中发现一个LMNA基因L530P 变异(第530 位亮氨酸突变为脯氨酸),Monkes 等[18]构建了L530P 小鼠模型。 6 个月龄的杂合子小鼠与WT 小鼠表型相似。纯合子小鼠在4-6 日龄时开始呈现早老表型,并在4～5 周内死亡,纯合子小鼠步态蹒跚、皮下脂肪层缺乏、毛囊密度降低、心肌和骨骼肌轻度至中度变性、发育不良和萎缩。 此外,研究者还发现小鼠成纤维细胞细胞核形态异常,lamin A 表达减少,lamin C 细胞核内定位错误。

2.4 LmnaE82 K 小鼠模型

在一个拥有50 个家族成员的中国人DCM 家系中发现LMNA基因的一个新突变E82 K,正是这种突变导致了DCM 的发生。 吕丹等[19]构建了E82 K转基因小鼠模型。 该转基因小鼠表现为心腔扩张、心脏重量增加、心肌纤维化增加,B 型钠尿肽、血清Ⅲ型前胶原和骨骼肌肌动蛋白α1 水平升高、核膜断裂和传导受损,这与携带E82 K 突变患者的表型相似。 有趣的是,我们发现E82 K 转基因小鼠的细胞凋亡水平是WT 小鼠的8.5 倍,Fas 和线粒体凋亡通路均被激活,这可能与左心室功能下降和最终心力衰竭有关。LMNA基因的E82 K 突变或Lamin A/C 杆状区突变都可能是导致心肌细胞凋亡和心室功能障碍的重要原因。 这可能是抑制LMNA突变患者心肌细胞死亡的一种潜在的治疗靶点。

3 LMNA 基因早老突变小鼠模型

3.1 LmnaHG小鼠模型

HGPS 是最严重的核纤层蛋白病之一。 为了研究该病的致病机制,Yang 等[20]构建了LmnaHG小鼠模型,该小鼠只产生progerin。 纯合子和杂合子小鼠都表现出与HGPS 患者相似的表现,包括皮下脂肪减少、脱发、骨质疏松症和过早死亡。 然而,该小鼠模型没有发现类似人类患者的心血管问题[20-22]。

3.2 携带LMNAG608G-BAC 致病基因的小鼠模型

第二个关于HGPS 的小鼠模型是通过产生带有细菌人工染色体(BAC) 的转基因来构建早老小鼠模型,BAC 携带LMNAG608G 突变( G608G BAC 小鼠模型)。 与LmnaHG小鼠模型不同,该转基因小鼠没有HGPS 外部表型,但血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs) 渐进性丢失,在一些HGPS 患者的尸检中也观察到这一特征。 目前还不清楚为什么这个模型的表型局限于VSMCs[22]。

3.3 金属蛋白酶ZMPSTE24 缺失型小鼠模型

ZMPSTE24 是一种在小鼠和人体内处理法尼基化prelamin A 的金属蛋白酶。 人体缺乏ZMPSTE24会导致限制性皮肤病(Restrictive dermopathy, RD)的发生,从而造成围产期死亡[23]。 Bergo 和Pendas等[24-25] 建立了2 种ZMPSTE24 缺失小鼠模型(Zmpste24-/-小鼠模型),这2 种小鼠模型都没有产生成熟的lamin A,反而因为缺失Zmpste24 而导致法尼基化prelamin A 蓄积。 在Bergo 等[24]构建的小鼠模型中,纯合子小鼠出生时表现是正常的,后来出现异常,包括生长迟缓、脱发、肌无力、最显著的是多发性骨折。 在Pendás 等[25]构建的小鼠模型中,纯合子小鼠表现出生长迟缓、DCM、肌营养不良、脂肪营养不良和过早死亡。 这2 个小鼠模型的表型都与HGPS 患者的表型相似,提示prelamin A法尼基化至少部分的影响了HGPS 的表型。 研究表明,法尼基化抑制剂( farnesyltransferase ( FTase)inhibitors, FTIs) 可以抑制progerin 蓄积或prelamin A 法尼基化,联合他汀类药物使用可以增加HGPS患者骨密度从而改善早老表型[26-27]。

3.4 LmnaG609G小鼠模型

早老小鼠模型中较为受到关注的是Osorio 等[28]构建的LmnaG609G小鼠模型,LmnaG609G/G609G小鼠在出生至出生后3 周生长速度减慢,体重进行性下降,不孕,姿势异常,脊柱后凸,平均100 日龄时过早死亡。 杂合子小鼠虽也出现过早死亡,但死亡率较低,大多数在出生后8 个月前都是正常表型,平均生存时间为242 d。 杂合子小鼠出现血管硬化,与载脂蛋白E 敲除(Apoe-/-)小鼠杂交出现动脉粥样硬化,主动脉钙化严重以及抑制血管钙化的能力受损[29]。 由于LmnaG609G小鼠模型出现了HGPS 患者中观察到的大多数变化,该小鼠模型已经成为寻找HGPS 患者治疗措施的首选模型。 研究者利用了反义寡核苷酸、药物、饮食以及激活体内的重新编程等来治疗LmnaG609G小鼠[30-31],最近,研究者利用CRISPR-Cas9 技术靶向干扰lamin A/ Progerin 来治疗HGPS, 治疗后的LmnaG609G小鼠抑制了表皮变薄和真皮脂肪丢失、改善了姿势、体重以及主动脉弓VSMCs 的退化。 小鼠看起来更活跃、健康、以及生存期延长[32]。

3.5 其他早老突变小鼠模型

Yang 等[33]考虑到非法尼基化progerin 有诱发疾病的可能性,因此构建了表达非法尼基化progerin小鼠模型(LmnanHG小鼠模型)。LmnanHG小鼠与LmnaHG小鼠表型相似但症状轻一些。LmnanHG小鼠胚胎成纤维细胞( mouse embryonic fibroblasts,MEFs)畸形细胞核百分率比LmnaHG小鼠低。 FTIs对LmnanHG小鼠MEFs 没有疗效。 这些结果表明,非法尼基化progerin 仍然是有毒性的,用FTIs 阻断法尼基化并不能完全逆转HGPS 患者的progerin 诱导的表型。 为了避免progerin 在早期发育过程中潜在毒性,以及progerin 对表皮角质形成细胞的影响,Mckenna 等[34]构建了一个在Tet 操纵子控制下表达lamin A 和progerin 的诱导系统。 分别表达野生型lamin A(tetop-LAwt 小鼠模型)和HGPS G608G 突变体(tetop-LAG608G小鼠模型)。 通过将tetop-LAwt 和tetop-LAG608G转基因小鼠与表达K5tTA 转基因小鼠杂交,突变基因的表达定向到毛囊间表皮和毛囊的基底细胞。 这些表达progerin 的双转基因小鼠中,最终表现出皮下脂肪丢失、纤维化和皮脂腺发育不完全。 其他值得注意的异常包括牙齿问题、脱发、生长迟缓和过早死亡。 由于HGPS 患者的皮肤受到严重影响,Wang 等[35]构建了利用角蛋白14 启动子(Keratin 14 promoter,K14 promoter)在表皮组织中表达progerin 的转基因小鼠模型(K14-progerin 小鼠模型),K14-progerin 小鼠分离的原代角质形成细胞虽然具有异常的核形态,但仍有正常的毛发和伤口愈合能力。 这些观察结果表明细胞异常与组织病理的严重程度并不一致。 正如Varga 等[22]提出的一样,某些组织如横纹肌,细胞不断受到机械压力,可能对核结构异常更敏感,而其他组织如表皮,尽管核形状发生了改变,也能够继续发挥生理功能。 最近研究发现,LMNA基因R527C 纯合突变会导致儿童早老症,但LMNAR527C 基因突变导致的早老症患者细胞内并没有 prelamin A 和 progerin 蓄 积[36]。 目 前,LMNAR527C 基因突变导致的早老症致病机制尚不清楚。 李东明等[37]构建了一个R527C 小鼠模型,观察LmnaR527C/R527C小鼠的表型,发现LmnaR527C/R527C小鼠未出现相关临床疾病的表型,但是小鼠皮肤组织γH2Ax蛋白水平升高,成纤维细胞衰老数量百分比增加,DNA 损伤增加,基因组不稳定,衰老加速。 这些结果表明细胞异常与组织病理的严重程度并不一致。

4 结语与展望

核纤层蛋白病类型复杂多样,引起人们的广泛关注,为了深入研究其分子机制,开发针对相应疾病的孤儿药,人们构建了多种种属的动物模型,比如斑马鱼[38]、尤加坦小型猪[39]、兔[40]等,而小鼠模型的构建尤为众多,本文概述了文献报道的主要核纤层蛋白病小鼠模型(见表1、表2、表3)。 考虑到物种间高度保守的基因组维持机制,核纤层蛋白病小鼠模型可以作为一个有价值的模型来研究个体和细胞衰老过程中代谢途径的改变和可能的治疗策略,以进一步提升我们对正常生理性衰老过程的认识,也有助于了解与衰老相关的慢性和退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、动脉粥样硬化、糖尿病和癌症等)的病理特征。

表1 LMNA 基因/ 片段缺失突变小鼠模型Table 1 Mouse models with LMNA gene or fragment deletion mutation

表2 LMNA 基因错义突变小鼠模型Table 2 Mouse models with LMNA gene missense mutation

表3 LMNA 基因早老突变小鼠模型Table 3 Mouse models with LMNA gene progeroid mutation