TMPRSS4在裸鼠结肠癌肝转移模型的促癌机制研究

于登峰，杨宇慎，王艺

大连大学附属新华医院普通外科，辽宁 大连 116021

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家的发病率和死亡率呈逐年递增趋势[1]。导致结直肠癌高死亡率的最主要原因是结肠癌的肝转移，一经确诊已有25%的肝转移率[2]。有研究指出TMPRSS4 与结直肠癌肝转移密切相关，但目前具体的转移机理未完全阐述[3]。TMPRSS4 是在胰腺癌组织中分离出的一种新型的跨膜丝氨酸蛋白水解酶[4]。近期对TMPRSS4表达研究证实，TMPRSS4高表达与胰腺癌的发生发展密切相关，且TMPRSS4 基因敲减可有效阻断肿瘤转移[5]；TMPRSS4高表达与肝细胞癌的进展和生存率显著相关，且是判断术后复发的独立预后因素[6]。近期对TMPRSS4 信号通路研究证实，TMPRSS4 诱导EMT 的发生与整合素α5、FAK 信号通路及ERK的激活密切相关[7-8]；还有一些研究发现两种新型的羟基二芳基酰胺衍生物IMD-0354和KRT1853通过抑制TMPRSS4 而可有效的减少癌细胞的侵袭、扩散以及凋亡[9]。

尽管目前对TMPRSS4 的研究取得了较大进展，但对其在结直肠癌肝转移中的作用机理尚未完全阐明。此外，KEPPNER 等[10]虽已成功建立起CAP2/TMPRSS4 敲除裸鼠模型，但到目前为止利用相似的动物模型来探讨TMPRSS4 的报道非常少。因此，本实验通过建立TMPRSS4表达裸鼠结肠癌肝转移模型来初步阐述TMPRSS4在裸鼠结肠癌肝转移模型中的促癌机制，为后续利用该模型进一步阐明TMPRSS4促癌作用的分子机理以及研发更为高效的TMPRSS4靶向药物打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 20 只6 周龄雌性nu-/nu-裸鼠购自大连医科大学动物研究中心；HT29人结肠癌细胞株购自美国ATCC 细胞研究中心；RPMI-1640 和新生胎牛血清购自Invirtogen；pcDNA3.1(-) 空白载体购自美国BD 公司；TMPRSS4抗体购自美国Protein Tech 公司；GAPDH 抗体购自美国Santa Cruz 公司；RT-PCR 和Western blot 所用的试剂由大连大学附属新华医院中心实验室提供。本研究经大连大学附属新华医院医学研究伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 TMPRSS4 基因质粒构建 将设计完好的TMPRSS4引物前后加上Hind Ⅲ和XhoⅠ限制性内切酶进行识别，并附上pcDNA3.1(-)空白载体的质粒中进行扩增，见图1。

1.2.2 稳定性转染细胞的构建 HT29 人结肠癌细胞密度在60%～80%融合并附着时进行转染。利用微震仪(Microporator MP-100；购自韩国Nano Entek 公司)将pcDNA3.1(-)/TPRSS4 和pcDNA3.1(-)/Scramble 质粒转染到HT29 人结肠癌细胞中。转染的HT29 人结肠癌细胞株传代培养并液氮保存，使其构建成生长或表达稳定的细胞株。

1.2.3 细胞悬液的制备 常规无菌培养已转染的HT29 人结肠癌细胞株，细胞融合至90%以上时收集细胞并在显微镜下计数，调整至细胞浓度为1×107/mL。细胞混悬液置于冰中待接种。

1.2.4 模型设计 实验动物购入后在模型前1 周防止进行任何刺激性操作。裸鼠共20 只，按随机数表法分成10 只TMPRSS4 组(研究组)和10只Scramble 组(对照组)，制模后观察6 周，见图2。

图1 重组pcDNA3.1(-)/TMPRSS4质粒构建

图2 模型设计

1.2.5 结肠癌肝转移模型的建立和肝转移评分标准[11]选择异氟醚进行全身麻醉。取5 mm 小切口入腹后轻轻牵出大网膜和脾脏。选择脾脏被摸中点，采用31G 注射器进针2 mm 左右，稳定注入已转染的HT29 人大肠癌细胞混悬液100 μL，止血纱布压迫注射部位前可见其周围有颜色改变及肿胀。数分钟后离断脾脏动静脉，从腹腔中移除脾脏，逐层关腹。肝转移评分标准：0 分，没有肝转移；1 分，肝脏浸及为轻微，浸润范围＜1.0 cm2；2 分，肝脏浸及为轻度，浸润范围1.0～2.0 cm2；3 分，肝脏浸及为中度，浸润范围2.0～3.0 cm2；4 分，肝脏浸及为重度，浸润范围3.0 cm2以上。

1.2.6 观察指标 每天常规观察并记录裸鼠的一般状态。裸鼠出现频死前症状或观察期满6周时予以处死。处死后立即解剖腹腔观察血性腹水、肝转移瘤情况；并解剖胸腔肺内注入碘伏水后，观察有无肺转移瘤情况。

1.2.7 组织形态学改变和病理学检测 将两组肝转移瘤组织标本进行形态学改变分析；并将肝组织分叶1 mm 间隔横行切开，蜡块包埋后按4 μm 厚度切片，两组进行H&E染色观察肝转移情况。

1.2.8 RT-PCR和Western blot检测 收集各组肝转移瘤和配对癌旁相对正常肝组织，其新鲜标本取材后保存在液氮中，备行RT-PCR 检测。TRIzol 试剂盒(购自美国Invitrogen 公司)提取RNA，测量RNA 纯度和浓度，电泳检测RNA完整性，热循环PCR仪进行逆转录反应及PCR 扩增。同上收集各组肝转移瘤和配对癌旁相对正常肝组织，其新鲜标本取材后保存在液氮中，备行Western blot 检测。进行蛋白提取、定量并调整各组总蛋白含量相等，SDS-PAGE 电泳和电转移。检测时将稀释成1∶1 000的TMPRSS4抗体和稀释成1∶4 000的GAPDH抗体置入4℃冰箱过夜，并在暗室曝光显影。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0 统计软件包进行分析。实验数据以均值±标准差(x-±s)表示，各组计量资料间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织标本的形态学和病理学变化 成功构建稳定型表达TMPRSS4 和Scramble 重组载体的HT29细胞株，并100%(20/20)成功完成两组裸鼠结肠癌肝转移模型。经统计分析，对照组肝转移评分为(2.400±0.516)分，明显低于研究组的(3.700±0.483)分，差异有显著统计学意义(P＜0.001)，见图3。

图3 两组结肠癌肝转移模型中组织形态学和组织病理学变化(20×)

2.2 组织标本的分子生物学变化 TMPRSS4的mRNA 和蛋白质表达强弱是以其表达条带光度值与GAPDH 表达条带光度值的比值(TMPRSS4/GAPDH)来表示。经统计分析，肝转移瘤中TMPRSS4的mRNA和蛋白质的TMPRSS4/GAPDH (1.640±0.207、1.860±0.445)明显高于配对的癌旁相对正常肝组织(0.340±0.114、0.106±0.060)；研究组TMPRSS4 的mRNA 和蛋白质的TMPRSS4/GAPDH(2.280±0.712、2.580±0.719)明显高于对照组(1.060±0.207、0.740±0.114)，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

图4 两组结肠癌肝转移模型中TMPRSS4表达

3 讨论

TMPRSS4 是首次发现于胰腺癌组织中的一种新型单通道跨膜丝氨酸蛋白水解酶，与上皮细胞癌的侵袭和转移密切相关[4]。本研究发现TMPRSS4 表达水平在结直肠癌肝转移组织中明显增高，且TMPRSS4的低表达能显著抑制肝转移的发生。

近年来，许多研究证实TMPRSS4 在不同上皮细胞癌中呈高表达状态。在三阴性乳腺癌，TMPRSS4过表达不仅提示预后差，且其表达水平还与肿瘤大小、淋巴结转移以及组织学分型密切相关[12]。在非小细胞肺癌(NSCLC)，LARZABAL等[13]指出肿瘤组织中TMPRSS4 含量高于正常组织，且鳞癌组织高于腺癌组织，而且该研究还首次证实了TMPRSS4 的表达与预后显著相关。在胃癌组织，LUO等[14]通过免疫组化证实TMPRSS4表达水平与年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、浸润深度、脉管侵犯、预后以及淋巴结和远处转移密切相关，这与本实验组近期的一项研究结果相一致[15]。因此，TMPRSS4 在肿瘤的发生发展中起着十分重要的调节作用。然而，目前对TMPRSS4 能否促进结直肠癌肝转移的发生鲜有报道。本研究采用基因重组质粒pcDNA3.1(-)/TMPRSS4 转染的HT29 大肠癌细胞株构建了两组裸鼠结肠癌肝转移模型，并以此来探讨TMPRSS4 在结肠癌肝转移中的作用。形态学和病理学结果显示与对照组相比，研究组裸鼠结肠癌肝转移评分显著增高。为了在分子层面上逆向证实TMPRSS4 与结肠癌肝转移的关系，本实验组采用RT-PCR和Western blot处理各组肝转移瘤和配对癌旁相对正常肝组织。结果表明：与正常组织相比，肿瘤组织中TMPRSS4的mRNA和蛋白质表达水平显著增高，这与JUNG等[3]报道相一致；此外，通过比较对照组和研究组的TMPRSS4 表达差异，发现研究组TMPRSS4的mRNA和蛋白质表达水平显著高于对照组。上述结果提示TMPRSS4 可促进结肠癌肝转移，且TMPRSS4低表达能显著降低肝转移瘤形成率。

目前，TMPRSS4 的促癌机制还未明确，但与此相关的数项研究都取得了令人欣喜的结果。在甲状腺癌，GUAN等[16]利用蛋白免疫印迹、实时RT-PCR以及荧光素酶试验证实，TMPRSS4可激活CREB/CyclinD1通路而促进癌细胞的增殖和发展。在肺腺癌，FAN等[17]利用线上数据库来探究miRNAs在TMPRSS4调节中的作用，发现miR-125a-5p 的低表达可上调TMPRSS4 的转录，进而通过激活细胞内NF-κB 信号通路而诱导EMT和肿瘤转移。更令人感兴趣的是TMPRSS4也可活化miR-205/整合素α5、E 型钙黏素轴而促进结直肠癌的侵袭和转移[18]。上述研究表明TMPRSS4 的致癌机理具有较强的细胞依赖性，这为临床上有针对性的研发肿瘤靶向药物提供了理论基础。与其他只关注TMPRSS4 作用靶点的研究不同，本实验组从TMPRSS4蛋白的自身分子结构出发，在实验过程中发现了TMPRSS4两种新的亚型T4-1A、T4-1B，并进一步证实包含激活功能区的T4-1A可促进结肠癌侵袭和转移，而T4-1B或只参与转录调节[19]。该发现无疑为进一步揭示TMPRSS4的作用机理提供了一个全新的思路。

本实验研究取得的阶段性结论结合前人的理论基础，总结如下观点：①在不同的上皮细胞癌中，TMPRSS4 的致癌机理存在差异，提示TMPRSS4 具有较强的细胞依赖性；②在结直肠癌，TMPRSS4/miR-205/整合素α5、E型钙黏素轴以及TMPRSS4两种新亚型可作为研究契机，在后续实验中将会明确TMPRSS4 调节miR-205 的具体机理，从而进一步阐明TMPRSS4在结直肠癌肝转移中的作用机制；③已知TMPRSS4/miR-205/整合素α5、E 型钙黏素轴作为信号传导通路的枢纽地位，可以此为靶点，研发更高效的新型靶向药物。

综上所述，本研究在in vivo平台上阐述了TMPRSS4 对结直肠癌肝转移的促进作用。TMPRSS4 可有效促进裸鼠结肠癌肝转移的进程，且TMPRSS4 低表达能显著抑制结直肠癌肝转移的发生，至于确保的促转移机制则有待于更加深入的研究揭示。