采用木瓜蛋白酶诱导建立兔腹主动脉瘤模型

毕永华，伊梦飞，陈红梅，韩新巍，任建庄，尉泽鹏

1)郑州大学第一附属医院放射介入科 郑州 450052 2)郑州大学附属郑州中心医院超声科 郑州 450052

小动物腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)模型常用于研究AAA的发病机制[1-4]。弹性蛋白酶诱导的AAA模型是大鼠和兔最常用的模型之一。然而，由于需要经髂总动脉插管，建模手术操作复杂，而且在灌注过程中可能出现弹性蛋白酶液渗漏进入血液，造成动物死亡。主动脉周弹性蛋白酶浸润也可诱发兔颈动脉AAA形成，但需要1～3 h，由于手术时间较长，可能导致高死亡率和手术失败。此外，日本学者Origuchi等[5]发现弹性蛋白酶浸润的兔AAA模型存在自愈现象。另一种常见的AAA模型是通过氯化钙诱导，但Isenburg等[6]认为即使采用直径增大20%的标准来定义AAA，仍只有2/3的大鼠可见AAA形成。弹性蛋白酶或氯化钙都通过诱导主动脉壁炎症，进而破坏主动脉壁形成AAA。木瓜蛋白酶是木瓜乳胶中提取的一种酶，具有很强的弹性蛋白分解能力，可以破坏血管壁。研究[7]发现木瓜蛋白酶能够诱导兔颈动脉形成囊状动脉瘤。作者通过木瓜蛋白酶浸润主动脉周简化AAA建模操作，大大缩短酶浸润所需的时间，以期为动脉瘤机制的研究提供新的动物模型。

1 材料与方法

1.1动物与主要试剂新西兰大白兔16只，由郑州大学实验动物中心提供，体重(2.06±0.33) kg。木瓜蛋白酶缓冲液(美国Sigma-Aldrich公司产品)；小鼠抗兔巨噬细胞单克隆抗体RAM11购自丹麦Dako公司；小鼠抗兔MMP9单克隆抗体购自Abcam公司；小鼠抗兔α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2实验分组与AAA模型的建立16只大白兔分为两组，每组8只。经耳缘静脉按30 mg/kg注射戊巴比妥钠麻醉大白兔。经腹部正中线剖腹，游离出主动脉分叉近端长约1 cm的主动脉段。实验组采用25 g/L木瓜蛋白酶缓冲液80 μL浸润20 min。生理盐水冲洗2次，清除残存的木瓜蛋白酶。对照组采用80 μL生理盐水浸润20 min。本研究通过郑州大学动物实验伦理委员会批准。

1.3彩色多普勒超声检查术后第5天和第21天两组各取4只大白兔进行彩色多普勒超声检查，测量浸润段主动脉的内径变化。主动脉内径增大至术前的1.5倍以上认为AAA形成。

1.4组织病理学观察超声检查后处死大白兔，取浸润段主动脉标本组织。体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm厚切片，EVG染色。采用Image J 1.41 软件分析，计算弹力纤维占主动脉壁中膜面积的百分比，以此表示弹力纤维面积百分比。

1.5MMP9、RAM11和α-平滑肌肌动蛋白表达的检测采用免疫组化SP法检测。取浸润段主动脉标本，以体积分数1%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，分别加入一抗RAM11(稀释100倍)和MMP9抗体(稀释300倍)4 ℃孵育过夜。PBS清洗3遍，DAB显色，苏木精复染。以细胞核出现棕黄色染色为阳性表达细胞。显微镜下(×200)观察α-平滑肌肌动蛋白的检测采用免疫荧光染色法。浸润段主动脉组织石蜡标本切片、脱蜡、脱苯、水化后，以体积分数1%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性。采用体积分数10%山羊血清封闭，加抗α-平滑肌肌动蛋白一抗(稀释150倍)4 ℃孵育过夜，加入FITC标记山羊抗小鼠IgG。采用Image J软件分析，计算α-平滑肌肌动蛋白阳性染色面积占主动脉壁面积的百分比，以此表示平滑肌细胞面积百分比。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0进行分析。两组大白兔术后第5天和第21天浸润段主动脉内径、弹力纤维和平滑肌细胞面积百分比的比较采用2×2析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组大白兔浸润段主动脉的变化术后第5天实验组大白兔浸润段主动脉均形成AAA，彩超检查可见瘤腔内血流紊乱，呈五彩色湍流信号，直径增大53.8%～100.0%。对照组均未发现AAA形成，彩超显示血流正常，未见湍流形成。两组大白兔浸润段主动脉内径变化的比较见表1。

表1 两组大白兔浸润段主动脉内径的比较 mm

2.2两组大白兔浸润段主动脉病理组织学变化见图1。实验组主动脉壁变薄、紊乱，伴瘤内血栓形成，弹力纤维层严重破坏；术后第5天残留的弹力纤维层变薄；术后第21天主动脉中膜增厚、可见断裂的弹力纤维，内膜增生明显、可见少量新生的弹力纤维，但排列紊乱，平滑肌细胞可见部分再生。对照组主动脉壁规则，中膜弹力纤维层排列规则，内外弹力纤维板完整，其弹力纤维无明显变化。两组大白兔浸润段主动脉弹力纤维和平滑肌细胞面积百分比的比较见表2。

A：实验组;B：对照组

表2 两组大白兔浸润段主动脉弹力纤维和平滑肌细胞面积百分比比较 %

2.3两组大白兔浸润段主动脉MMP9和RAM11的表达见图2。术后第5天实验组主动脉壁MMP9表达升高，第21天呈中度表达；术后第21天对照组未见MMP9表达。术后第5天实验组RAM11呈中度表达，第21天时表达下降，几乎仅局限于血管外膜；对照组RAM11几乎不表达，术后第21天仅在外膜中可见较弱表达。

A：MMP9;B：RAM11

3 讨论

我们通过主动脉周围浸润2 mg木瓜蛋白酶20 min成功建立兔新型AAA模型。AAA特征性表现为细胞外基质降解、中层破坏、MMPs和炎症因子表达上调。本研究结果显示实验组可见弹力纤维和中膜破坏以及平滑肌细胞减少；免疫组化染色显示实验组术后第5天内源性MMP9的表达上升，符合AAA的特征性表现。

AAA模型最常见的建模方法是动脉腔内灌注猪胰弹性蛋白酶溶液[1-4]。主动脉周浸润氯化钙或弹性蛋白酶也很多见。此外，国外作者[7]首次采用动脉腔内灌注木瓜蛋白酶成功诱导兔颈总动脉囊状动脉瘤形成。本研究首次采用主动脉周木瓜蛋白酶浸润法成功诱导兔AAA形成。该建模方法浸润时间为20 min，明显短于弹性蛋白酶浸润法所需的时间(1～3 h)，有利于提高建模成功率。采用主动脉周浸润法建模，不需要穿刺血管、阻断血流，建模操作大大简化，明显优于动脉腔内弹性蛋白酶灌注法。后者需要穿刺髂总动脉并插管，暂时阻断腹主动脉血流，灌注时还需要避免弹性蛋白酶渗漏进入血液，造成动物死亡。此外，瘤内血栓可能在AAA发病机制和动脉瘤破裂中起作用，但在弹性蛋白酶诱导的模型中却鲜有报道。本研究可见血栓形成，这与文献[7]的报道类似，有助于对瘤内血栓与AAA机制的关系进一步深入研究。

日本学者Origuchi等[5]报道，主动脉周弹性蛋白酶浸润诱导的兔AAA，术后6周后直径逐渐回缩，3个月后可自我愈合，恢复正常主动脉形态，这与人AAA疾病有很大不同。然而，Ding等[8-9]认为弹性蛋白酶诱导的颈动脉瘤模型的长期通畅性良好，并未发现自愈现象。本研究的动脉瘤模型在5 d后仍可见进展，这与Origuchi等[5]的结果有所不同。然而，本研究仅观察到21 d，需进一步的长期随访研究。另外，动脉粥样硬化是人AAA的主要发病机制，其他危险因素也与人AAA的形成和发展有关，本模型无法评估动脉粥样硬化等因素的影响。

总之，我们提出了一种新的AAA建模方法，该方法简单、有效，将有助于阐明动脉瘤疾病的发病机制。