解淀粉芽孢杆菌TF28不同施用方式对棚室连作黄瓜根际土壤细菌多样性的影响

胡基华 李晶 曹旭 姜威 陈静宇 孟利强 张淑梅

摘要：为了研究棚室黄瓜连作障碍，利用微生物菌剂改善连作产生的土壤问题，将解淀粉芽孢杆菌TF28以液体（L）、颗粒（P）、复合（LP）3种形式施用，取苗期、花期、盛果期、结果后期土壤样品，采用高通量测序技术对施用TF28与不施用TF28（CK）处理的土壤细菌多样性、群落组成进行比较分析，并对菌群代谢功能进行预测。结果显示，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）为8个优势菌门。Haliangium、Asanoa、Microvirga 3个属与CK差异明显。结果3种处理的菌群功能预测结果比CK好，其中P处理预测结果比其他2种处理好，对棚室连作黄瓜土壤调节稳定。本研究为改善棚室连作黄瓜障碍，实现设施蔬菜持续稳定健康生产提供理论依据。

关键词：高通量测序;连作障碍;细菌丰度;代谢功能;施用方式

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）18-0262-07

收稿日期：2019-11-14

基金项目：黑龙江省院所基本应用技术研究专项（编号：ZNBZ2018SW02）。

作者简介：胡基华（1970—），女，吉林长春人，博士，副研究员，主要从事生物防治方面研究。E-mail：158631375@qq.com。

通信作者：张淑梅，博士，研究员，从事微生物药物研究。E-mail：shumeizhang@Yahoo.com。

连作障碍备受关注[1]，研究表明土壤微生物区系改变是造成作物连作障碍的重要因素之一[2]。在东北地区，黄瓜（Cucumis sativas L.）是設施蔬菜的主要栽培种类，1年可多茬栽种，农民为了经济效益盲目增加肥料投放量，更加剧了土壤营养失衡。土壤产出率虽高，但得不到修复、连年恶化，随着时间积累作物生理病害日益严重，产量和品质也随之下降[3-5]。土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，可以提高土壤肥力、维持土壤生态系统物质的良性循环，一定程度上抑制作物土传病害[6]。微生物群落结构越丰富，多样性越高，对抗病原菌的综合能力越强[7]。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在自然界中分布广泛，是一类重要的生防资源菌，具有较高开发价值[8-9]，在植物病害生物防治方面具有广阔的应用前景[10]。内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） TF28是从大豆根部分离出的1株内生细菌，具有广谱抗菌活性[11]。前期研究发现，它可以改善棚室连作土壤的pH值，增加土壤细菌、放线菌生物量，降低真菌生物量，同时对磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶具有调节作用;对黄瓜的根系发育具有促进作用[12]。本研究基于前期试验结果，选取苗期、花期、结果期和结果后期土壤样品，采用高通量测序技术，对棚室连作黄瓜根迹土壤细菌群落丰度动态变化和菌群功能进行研究预测，以期为微生物改善连作障碍、改良土壤健康状况提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用菌株由黑龙江省科学院微生物研究所生物工程重点实验室分离保存。试验地点：黑龙江省哈尔滨市太平镇兴业村。2018年2月穴盘育苗，4月5日棚室移载;菌液浓度为108 CFU/mL，颗粒剂含菌量为2×108～3×108 CFU/g。菌剂施用方法：（1）液体样品（L）施用法：移栽时在苗根部浇施 5 mL（108 CFU/mL）/颗;（2）颗粒剂（P）施用法，瓜苗移栽前穴施5 g（2×108～3×108 CFU/g）/颗;（3）复合[LP（菌液+颗粒剂）]施用法：移栽时穴施5 g（2×108～3×108 CFU/g）/颗，移栽后浇施菌悬液 5 mL（108 CFU/mL）/颗。以不施用TF28的处理为空白对照（CK）。日光温度南北跨度50 m，东西跨度 7 m，黄瓜种植行距50 cm，株距35 cm。按周取样，采用五点取样法取根际5～10 cm处土壤，混合过 2 mm 筛，于-80 ℃冻存备用。

1.2 土壤微生物基因组DNA提取

根据前期TF28对黄瓜的生育指标、pH值、酶（磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶）活性的试验结果[12]，选用苗期（第2～3周）、花期（第4周）、盛果期（第6～7周）、结果后期（第10周）6个时间段的24组样品，送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行DNA提取和高通量测序。使用OMEGA土壤试剂盒（D5625-01）提取细菌总基因组DNA样本，-20 ℃ 存储。分别用NanoDrop ND-1000分光光度计（美国赛默飞世尔科技有限公司生产）和琼脂糖凝胶电泳法测定DNA的提取量和质量。

1.3 聚合酶链式反应（PCR）扩增及高能量测序

提取的DNA以v3和v4为目标区域进行PCR扩增，引物序列为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）及806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），扩增产物在Illumina Miseq平台上进行高能量测序。

1.4 对根际土壤细菌群落的分析

对Illumina Miseq测序平台所得数据进行处理，去除低质量序列（长度<150 bp、测序碱基质量值<20的序列，即模糊碱基和单核苷酸重复>8 bp 的序列），得到优质序列进行下游分析。在嵌合体检测之后采用UCLUST软件以97%相似度进行操作分类单元（OTU）划分，按丰度高低使用QIIME软件构建稀释性曲线。通过Galaxy在线分析平台进行LEfSe分析，对样本（组）间进行分类学组成的差异分析。使用Mothur软件，调用Metastats（http：//metastats.cbcb.umd.edu/）的统计学算法，对门、属水平的各分类单元在样本（组）间的序列量（即绝对丰度）差异进行两两比较。菌群代谢功能使用PICRUST预测工具，将现有的16S rRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物参考基因组数据库相对比，从而实现对细菌和古菌代谢功能的预测，根据不同物种16S rRNA基因拷贝数的差异，对原始数据中的物种丰度数据进行校正。

1.5 数据分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析，应用ANOVA单因素（LSD法）进行显著性检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤微生物群落丰度及多样性

3种处理6个时间点共计24个样本，共获得804 159条高质量的内转录间隔区（ITS）序列。土壤细菌覆盖度（coverage）指数为0.909 8～1.000，测序数据量合理，测序数据基本涵盖棚室连作黄瓜土壤中所有细菌类群，能体现土壤环境中细菌特征。按97%的序列相似度进行归并共产生10 398个OTU，L、P、LP和CK所特有的OTU数量分别为679、773、717、713（图1-a）。多样性Simpson和Shannon指数第4周P处理均为最高，分别为 0998 619 和10.50（表1）;丰富度Chao1和ACE指数在第6周P处理有最高值，分别为4 043.64和 4 172.24;可视物种在第2周LP处理显示为最高值3 044.00。

2.2 不同处理棚室连作黄瓜土壤细菌群落组成

根据获得的OTU丰度矩阵，使用R软件计算各样本（组）独有及共有OTU数量，L、P、LP和CK的OTU分别为679、773、717和713（图1-a）。OTU共注释到31个门，106个纲，218个目，424科，1 008个属和1 769个种。门水平丰度前20用柱形标示（图1-b），其中大于1%的有8个，分别是变形菌门（Proteobacteria，43.52%）、放线菌门（Actinobacteria，25.80%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，7.19%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，7.00%）、绿弯菌门（Chloroflexi，632%）、酸杆菌门（Acidobacteria，438%）、厚壁菌门（Firmicutes，1.89%）、螺旋体菌门（Saccharibacteria，1.85%），变形菌门为主要优势菌类群。1 008个属丰度高于1%有17个，其中4个为变形菌门，3个为放线菌门、绿弯菌门和拟杆菌门，芽单胞菌门、放线菌门、螺旋体菌门和厚壁菌门各有1个。

2.3 不同处理样本间差异分析

表2显示，门水平两两比较发现P-CK中绿菌门（Chlorobi）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门这5个具有差异性;L和CK两两比较中酸杆菌门具有差异性（表3）。属水平比较中，P和CK具有差异性的样本（组）共有44个（表2、表4），L和CK有28个，LP和CK有15个。属水平样本（组）间差异最显著的前20个分类单元的丰度分布情况用小提琴图标示（图2），其中Asanoa、Georgenia、Microvirga的3个处理与CK差异最为明显。

2.4 菌群代谢功能预测

根據PICRUST预测结果，共有功能类群数量为5 757（图3-a）;两两重叠部分数量分别是3（L/CK）、6（L/LP）、8（LP/P）、14（L/P）、7（P/CK）、7（LP/CK）;三重叠部分数量分别为12（CK/L/LP）、44（L/LP/P）、7（CK/L/P）;L、LP、P和CK独有功能菌群数量分别是21、58、16和5。如高丰度前50位的功能类群聚类分析绘制热图（图3-b）所示，将两大区块按丰度高低再分为4个区块（图3-b黄线分割）。在10个高丰度功能类群中，3个处理组各有3个，CK有1个;在14个低丰度样品中，3个处理组各有3个，CK有5个。P处理6个时间段分别在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区，4个区均有L、LP处理。部分类群功能见表5。

3 讨论与结论

微生物在土壤有机质形成和养分转化循环中有重要作用[13]，土壤微生物群落结构、多样性、活性是影响连作障碍的主要因素[14]，同时也是维持土壤生态系统稳定性和可持续性的重要保证。设施蔬菜连作会导致土壤微生物群落结构单一、有害微生物数量增多[15]。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） TF28能够产生多种抗菌物质，具有广谱抑制植物病原真菌的功能[16]。本研究结果显示，3种处理在苗期、花期、盛果期、结果后期土壤微生物的群落结构差异不大，连作并未造成土壤菌群生物量大量减少，菌群构成较稳定。但是在花期、盛果期，土壤微生物相对丰度存在较大差异，这与前人研究结果[17-19]相似。P处理在第4周（花期）和第6周（盛果期）多样性指数与丰富度指数达到最高值，明显高于其他2种处理和空白对照，根际微生物主要类群的数量与其生长发育呈正相关关系，这与前人研究结果[20]一致。土壤细菌群落组成结果表明，变形菌门为优势类群、其次为放线菌门和芽单胞菌门，连作会造成土壤微生物选择性的适应，造成某些种群富集，而另一些种群数量降低的现象[17]。与CK相比，P处理提高硝化螺旋菌门微生物量，硝化螺旋菌门具有固氮作用和良好的根际效应，相关结论有待后续试验验证。酸杆菌门是L和P处理与CK共同差异菌门，特别是P处理酸杆菌门OTU相对丰度比CK提高60.4%，显示了明显的调节作用;已有的研究表明酸杆菌广泛存在于自然界的各种环境中，占土壤细菌类群的5%～46%或者超过50%[21-22]，大多为嗜酸菌，对土壤pH值极为敏感[23]。3种处理对Haliangium、Acidibacter、Microvirga具有明显的调节作用（表4、图3），Haliangium为一种中度嗜盐菌群[24]，Acidibacter为一种嗜酸铁离子还原菌[25]，Microvirga具有明显的溶大肠杆菌活性，抑制马铃薯晚疫病菌活性[26]。菌群代谢功能预测L、LP、P特有数量均比CK高;三重叠部分数量CK与L、LP组和L、P组数量分别是12和7，而L、LP、P重叠部分数量为44，差异明显，2组数据说明3种处理与空白对照相似度小，对土壤微生物的功能作用高于空白对照。LP2、L10、CK10 3个时间段在Ⅰ区功能类群丰度值相对较高，这可能是苗期土壤微生物代谢功能健康，结果后期植株需要养分较少，同时土壤具有自我修复能力的表现。菌群代谢功能结果显示，TF28提高了连作土壤整体细菌群系的功能包括生物降解和代谢、类萜化合物和聚脂化合物的代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、多糖和单糖生物合成和代谢等，代谢功能作用将在后续工作中继续研究证实。

本研究结果说明，解淀粉芽孢杆菌TF28对棚室连作黄瓜根际土壤具有改善作用，3种处理对土壤微生物细菌群落丰度及多样性与CK无明显差异，对连作黄瓜土壤中细菌群落组成与CK差异明显。TF28对棚室连作黄瓜土壤具有一定的调节修复作用，P处理与L和LP相比表现出良好的根际效应和稳定的改善作用。

参考文献：

[1]贺丽娜，梁银丽，高 静，等. 连作对设施黄瓜产量和品质及土壤酶活性的影响[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（5）：154-159.

[2]Yin B，Crowley D，Sparoved G，et al. Bacterial functional redundancy along a soil reclamation gradient[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（10）：4361-4365.

[3]何莉莉，陈 阳，陈俊琴，等. 黄瓜连作栽培中营养基质的微量元素、病原菌和产量的变化[J]. 沈阳农业大学学报，2010，41（1）：13-17.

[4]许云翔，何莉莉，刘玉学，等. 施用生物炭6年后对稻田土壤酶活性及其肥力的影响[J]. 应用生态学报，2019，30（4）：1110-1118.

[5]吴凤芝，刘 德，栾非时. 大棚土壤连作年限对黄瓜产量和品质的影响[J]. 东北农业大学学报，1999，30（3）：245-267.

[6]张 超，朱三荣，田 峰，等. 不同绿肥对湘西烟田土壤细菌群落结构与多样性的影响[J]. 贵州农业科学，2016，44（5）：43-46.

[7]姜佳昌. 四种除草剂对燕麦田土壤微生物数量的影响研究[J]. 甘肃畜牧兽医，2015，45（10）：26-29.

[8]Adnan N，Shahid M，Sarosh B，et al.Complete genome sequence of a plant associated bacterium Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum UCMB5033[J]. Standards Genomic Sciences，2014，9（3）：718-725.

[9]张龙来，康向辉，魏孝义，等. 一株解淀粉芽孢杆菌HN011抑菌次级代谢产物的分析[J]. 华南农业大学学报，2016，37（1）：63-69.

[10]车晓曦，李校堃. 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的研究进展[J]. 北京农业，2010（3）：11-14.

[11]张淑梅，沙长青，王玉霞，等. 大豆内生细菌的分离及根腐病拮抗菌的筛选鉴定[J]. 微生物学通报，2008，35（10）：1593-1599.

[12]胡基华，李 晶，张淑梅，等. 解淀粉芽孢杆菌TF28对设施连作黄瓜根际土壤酶活性和微生物的调节[J]. 江苏农业科学，2020，48（7）：152-156.

[13]庞 欣，张福锁，王敬国. 根际土壤微生物量氮周转率的研究[J]. 核农学报，2001，15（2）：106-110.

[14]李兰君，刘玳含，刘建斌，等. 连作对设施番茄土壤微生物及酶活性的影响[J]. 江苏农业科学，2018，46（18）：130-134.

[15]邹春娇，张勇勇，张一鸣，等. 生物炭對设施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物的调节[J]. 应用生态学报，2015.26（6）：1772-1778.

[16]张淑梅，王玉霞，孟利强，等. 内生解淀粉芽孢杆菌TF28液体发酵条件研究[J]. 东北农业大学学报，2013，44（11）：19-24.

[17]胡元森，吴 坤，李翠香，等. 黄瓜连作对土壤微生物区系影响Ⅱ——基于DGGE方法对微生物种群的变化分析[J]. 中国农业科学，2007，40（10）：2267-2273.

[18]Deheridge A P，Brand G，Fychan R，et al.The legacy effect of cover crops on soil fungal populations in a cereal rotation[J]. Agriculture，Ecosystems & Environment，2016，228：49-61.

[19]Nair A，Ngouajio M.Soil microbial biomass，functional microbial diversity，and nematode community structure as affected by cover crops and compost in an organic vegetable production system[J]. Applied Soil Ecology，2012，58：45-55.

[20]胡元森，吴 坤，刘 娜，等. 黄瓜不同生育期根际微生物区系变化研究[J]. 中国农业科学，2004，37（10）：1521-1526.

[21]Lee S H，Ka J O，Cho J C. Members of the phylum Acidobacteria are dominant and metabolicallyactive in rhizosphere soil[J]. FEMS Microbiology Letters，2008，285（2）：263-269.

[22]Ellis R J，Morgan P，Weightman A J，et al. Cultivation-dependent and independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal contaminated soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（6）：3223-3230.

[23]王春香，田宝玉，吕睿瑞，等. 西双版纳地区热带雨林土壤酸杆菌（Acidobacteria）群体结构和多样性分析[J]. 微生物学通报，2010，37（1）：24-29.

[24]Fudou R，Jojima Y，Iizuka T，et al. Haliangium ochraceum gen. nov.，sp. nov. and Haliangium tepidum sp. nov.：novel moderately halophilic myxobacteria isolated from coastal saline environments.[J]. Microbiology Research Foundation，2002，48（2）：109-115.

[25]Falagn C，Johnson D. Acidibacter ferrireducens gen. nov.，sp. nov.：an acidophilic ferric iron-reducing gamma proteobacterium[J]. Extremophiles，2014，18：1067-1073.

[26]赵璞钰，任兴波，丁一秀，等. 三株微枝形杆菌属菌株的分离鉴定及其抗马铃薯晚疫病菌活性分析[J]. 科学技术与工程，2017，17（2）：170-175，210.