雷公藤多苷与呋塞米联用治疗肾病综合征人体内相互作用机制的网络药理学通路预测*

袁薪蕙，李自强，黄宇虹，王保和，杜 犀

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250）

雷公藤多苷（TG）为中药雷公藤的提取物，有免疫抑制与抗炎作用，可用于治疗原发性肾病综合征[1]。呋塞米为临床常用与首选的治疗水肿的袢利尿剂[2]。二者在临床治疗肾病综合征方面应用广泛。目前这类草药与化药联用时人体内的药物相互作用[3]正在成为研究热点。传统的药物相互作用研究通常通过人体药代动力学[4]实验中血药浓度差异或药效学人体生化指标的变化推断两药之间的协同或拮抗作用，进一步深入的机制研究通常借助于动物实验或体外实验，故笔者探索性地采用网络药理学的方法，在实验室研究前预测靶点与通路，以期探索在雷公藤多苷与呋塞米共同进入人体后可能发生的药物相互作用机制。

1 资料与方法

1.1 主要活性成分预测 通过检索TCMSP、ChEMBL、PubChem Compound数据库和已发表文献获得TG的化学成分、分子结构及其化学性质和呋塞米的分子结构及其化学性质。保存两种药所包含化学成分的结构式（.sdf格式）或Smiles号。

根据类药五原则[5]筛选TG主要活性成分。类药五原则要求化合物分子质量（MW）≤500、氢键给体（n OHNH）≤5、氢键受体（n OH）≤10、脂水分配系数（X LogP）≤5、可旋转键 RBN＜10。该原则的目的是筛选出生物体内代谢过程中生物利用度更符合口服药物条件的成分[6]。

1.2 潜在作用靶点预测

1.2.1 潜在作用靶点预测 在PharmmapperServer[6-8]、SEA、Swiss target prediction数据库输入1.1获得的药物成分，分别获得并汇总TG和呋塞米人体潜在作用靶点。在Uniprot数据库，获得这些靶点对应的人类基因，建立excel数据库。

1.2.2 人体肾病综合征潜在作用靶点预测 在GeneCards数据库获得人类肾病综合征疾病的靶点（基因）。

1.2.3 两药人体肾病综合征潜在靶点预测 通过合并1.2.1与1.2.2靶点，分别获得TG主要成分、呋塞米分别对应的人体肾病综合征相关靶点，进行对比分析，并找出两药共同作用靶点。

1.2.4 核心靶点预测 在String数据库分别导入TG与呋塞米的靶点（在1.2.3获得），获得两药各自靶点间相互作用（PPI）关系，保存为.TSV格式，把文件中node1和node2数据导入Cytoscape 3.6.1软件，获得参数Degree，以“Degree≥2倍中位数”为标准分别筛选出两药核心靶点[9]。

1.3 网络构建

1.3.1 PPI网络图 分别将1.2.4得到的两药核心靶点导入String数据库，将node1、node2、Combined score数据导入Cytoscape 3.6.1软件，获得两药的靶点相互作用网络，进行对比分析。

1.3.2 核心靶点组织分布预测 使用BioGPS数据库，筛选出两药核心靶点的主要组织分布（定义该靶点的基因表达量大于中位数的组织为靶点的主要分布组织）；使用Cytoscape软件构建作用靶点-组织分布网络图，得出TG、呋塞米治疗肾病综合征主要分布的组织或器官。

1.3.3 “化合物-靶点”网络图 利用Cytoscape 3.6.1软件构建两药治疗肾病综合征的化合物-靶点网络关系图。

在Systems Dock Web Site Version 2.0网站分别对TG化合物、呋塞米与其肾病综合征靶点进行分子对接验证。取TG的Degree排名前4位靶点、呋塞米的全部靶点进行验证，获得Docking Score用以评价两药化合物与靶点之间的结合活性。同时评价与对比TG、呋塞米与人体肾病综合征靶点的结合程度差异。

1.3.4 “化合物-核心靶点-信号通路”网络图 在DAVID网站分别对两药靶点进行KEGG通路富集分析。参数设置为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Species选择homo sapiens，选择functional annotation tool。利用Cytoscape3.6.0软件绘制“化合物-靶点-信号通路”网络图，进行对比分析。

2 研究结果

2.1 化学成分的确定 通过数据库与文献检索，共获得TG中化学成分48种[10-15]。其中主要化学成分14个，为雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤内酯酮、山海棠素、雷公藤对琨B、雷公藤对琨H、雷公藤对琨A、雷公藤内酯三醇、TriptobenzeneH、Triptobenzene A、Triptohairic acid（雷酚萜酸）、Tripterifordin、Triptonolide、Celafurine。其结构式如图1。化学性质如表1所示。呋塞米分子结构如图2，化学性质如表2，TG主要化学成分与呋塞米均符合类药五原则人体口服药物条件。

表1 雷公藤多苷主要活性成分及其部分性质Tab.1 The main active ingredients and properties of TG

表2 呋塞米化学性质Tab.2 Furosemide chemical properties

2.2 核心靶点预测

2.2.1 两药人体内肾病综合征靶点预测 检索获得肾病综合征相关人类基因1 124个；TG主要化合物人体作用靶点共768个；呋塞米人体作用靶点377个。合并整理得到TG人体肾病综合征作用靶点136个；呋塞米人体肾病综合征作用靶点81个。

呋塞米能作用到肾病综合征所有靶点的7.21%，占呋塞米全部作用靶点的21.54%。TG能作用到肾病综合征所有靶点的12.19%，占TG所有作用靶点的17.84%。TG覆盖呋塞米本病作用靶点70个，占呋塞米本病作用靶点的86.42%，占雷公藤多苷本病作用靶点的51.1%。见图3。

研究结果提示TG覆盖人体肾病综合征靶点多于呋塞米，且覆盖呋塞米的大部分肾病综合征靶点。

2.2.2 核心靶点预测 筛选出TG核心作用靶点（Degree＞48）26 个：RELA、GSR、PTGS2、MTOR、NOS2、MMP2、IGF1、MPO、NOS3、SRC、F2、ACE、MAPK1、EGFR、CASP3、JUN、G6PD、IL1B、CYP3A4 、CXCL8、SERPINA1、TP53、MMP9、AKT1、IL6、ALB。

呋塞米核心作用靶点（Degree＞34）10个：ALB、AKT1、MMP9、MAPK1、EGFR、SRC、CASP3、IGF1、PTGS2、ICAM1。除ICAM1外，均为TG共同的核心作用靶点。

2.3 PPI网络图 核心靶点相互作用的网络见图4。其中左侧为TG的PPI网络，右侧为呋塞米的PPI网络。图中圆形代表连接度Degree，圆形越大，提示与其相互作用靶点数量越多，该靶点的作用越关键。直线反映Combine score。直线越粗，提示Combine score越高，即两靶点间相互作用越强[9]。

网络图显示，TG 的 ALB、AKT1、IL6、TP53、CXCL8、CASP3、PTGS2、MMP9、MAPK1、IL1B、NOS3 几个靶点与其他靶点联系较为密切，作用较为关键。呋塞米的核心靶点数量较少，其两两之间均有联系，故地位同等。但是相互作用强度各不相同。图中显示，SRC与MMP9、IGF1、MAPK1、EGFR，EGFR与MAPK1，IGF1与ALB、MAPK1、AKT1的结合强度高于其他靶点。

2.4 两药核心靶点组织分布预测 图中三角形为药物靶点，圆形为组织或器官。三角形越大，提示靶点分布的组织数量越多；圆形越大，提示该组织的靶点数量越多。图中直线表示靶点与组织的分布关系。直线越粗，提示在该组织中靶点的基因表达量越大。

两药共同的主要组织分布有肝、骨髓、全血、平滑肌、肺、全脑、脑桥、扁桃体、子宫、前列腺、心肌细胞、T细胞、B细胞、淋巴细胞、支气管上皮细胞等。靶点在上述组织基因表达量也高于其他组织。TG靶点单独分布较多的组织有小肠、气管、睾丸等，呋塞米靶点单独分布较多的组织有胸腺、松果体、小脑脚掌、肾上腺皮质等。见图5。

2.5 化合物-核心靶点网络图 两药化合物-靶点网络图见图6。其中方形为药物成分，圆形为靶点。绿色部分为TG主要化学成分作用的肾病综合征核心靶点，红色部分为呋塞米及其肾病综合征核心作用靶点。黄色部分为TG与呋塞米共同作用的人体内肾病综合征核心靶点，分别为AKT1、ALB、MMP9、MAPK1、SRC、IGF1、EGFR、CASP3、PTGS3。

2.6 分子对接验证 Score越大，提示两者结合活性越好。Score＞4.25认为具有一定结合活性；Score＞5.0认为结合活性较好；Score＞7.0认为具有强烈结合活性[16]。TG的Docking score平均值5.748，最大值7.885，最小值4.113。总体上，化合物与靶点蛋白具有较好的结合活性。呋塞米分子对接验证的Docking score平均值4.51，最大值5.148，最小值3.569。测试靶点中只有ALBU、CASP3与呋塞米结合较好；SRC和ICAM和呋塞米一定程度上能够结合。其他均Score值较低或无法获得。对比研究显示，呋塞米的化学性质虽然也同样符合类药物原则，但是分子对接验证显示与雷公藤多苷主要活性物质相比，呋塞米与人体肾病综合征靶点的结合活性较差。

2.7 化合物-靶点-信号通路网络图 筛选出两药基因百分比＞10%且P＜0.01的信号通路。化合物-靶点-信号通路网络图见图7。其中绿色部分为TG化合物及其作用靶点，黄色部分为TG与呋塞米共同作用靶点，紫色箭头图标为两药通过作用于靶点在人体内干预到的信号通路。网络图7提示，TG与呋塞米虽作用靶点不全相同，但均可作用到这些信号通路，所以在药效或药代动力学方面有相互协同作用或其他药物相互作用。

3 结论

雷公藤多苷与呋塞米共同使用在治疗人类肾病综合征方面存在潜在的体内药物相互作用。两药共同作用于人体多个组织中的多个靶点。其中ALB、AKT1、MMP9、MAPK1、EGFR、SRC、CASP3、IGF1、PTGS2为两药潜在的共同核心靶点。它们通过干预TNF、MAPK、Toll样受体等多条信号通路影响疾病治疗。

4 讨论

雷公藤多苷由雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤内酯酮等多种有效成分协同发挥药效，通过纯化保留并加强了中药雷公藤的药效[17]。呋塞米为常用的治疗水肿的袢利尿剂。两者通过同时口服进入人体后或存在草药与化药之间的相互作用。

本研究讨论的雷公藤多苷14种主要活性成分进入人体内，通过作用于肾病综合征相关的靶点和靶点两两之间的相互作用，分布于体内各个组织器官，同时作用于通路中的这些靶点，而对体内信号通路产生影响，从而干预疾病的发展。这是符合中草药多靶点多通路[18]治疗疾病的特点的。而呋塞米作为单一成分药效精专的化药，本研究显示它也会作用到部分相同靶点，对这些信号通路产生某种程度的影响。所以提示两药间确是存在相互作用。但二者也存在差异。从数量上来看，呋塞米治疗肾病综合征的核心靶点（10）不及TG的一半（26），从结合强度上来看，TG与靶点的结合强度均较好，而呋塞米仅与部分靶点一定程度结合，两者Docking score的平均值相差1个等级。可见，TG对信号通路的影响程度是明显大于呋塞米的。

但是这并不能说明在治疗肾病综合征方面TG优于呋塞米。两者并无药效上的可比性。TG的药效主要集中在抗炎、免疫抑制或免疫调节方面。而呋塞米类抗利尿剂主要通过抑制肾小管对NaCl的重吸收，改变渗透压梯度差，达到利尿的效果。两者的治疗原理和侧重点是不同的。从药效上看，两者分别从抗炎、免疫调节和利尿多个方面对肾病综合征产生分工明确的协同治疗作用。呋塞米在专于利尿的同时，对雷公藤多苷多靶点多通路调节产生一定协同作用，可进一步通过实验验证。推测呋塞米很可能因改善Na+的重新收，影响渗透压，在直接产生利尿作用影响水液代谢的同时，改善了细胞环境，从而间接地影响了代谢通路。

笔者认为：网络药理学的本质是数据挖掘，通过对已有的数据一系列整合，针对新问题得出新结论。本研究的意义在于在实验研究前为两药相互作用的靶点和通路提供一定的线索，使后续实验有的放矢，节约经费。但是本研究同时存在一些不足之处。首先讨论范围集中在TG符合类五原则的14种化学成分，而实际临床使用的雷公藤多苷片包含这些以外的其他很多种成分如雷公藤红素等[19]。其次本研究主要讨论的核心靶点、组织以及通路是按照排名截取的关键部分，并不能代表全部。比如在组织分布中，TG的主要结合靶点分布于小肠，而呋塞米未显示小肠，但是在实际人体中不能排除呋塞米的某些非关键靶点分布于小肠。此外，本研究目的是讨论两药在治疗肾病综合症方面的相互作用，故首先检索了肾病综合征相关人类靶点。如果针对其他疾病靶点进行研究，可能会为药物尤其是中草药扩大应用范围提供理论上的可能性。这也拓宽了网络药理学的应用范围。