金匮肾气丸调控β-catenin 通路治疗去卵巢小鼠骨质疏松

陈一洲 叶勇健 李之斌 陈丹琦

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一类以骨量流失，骨微结构异常导致骨骼脆性增加的代谢性疾病。中医认为，PMOP 属于“骨萎”范畴，其根本病机为“肾虚”。金匮肾气丸作为温补肾阳的经典代表方[1]，广泛应用于PMOP 患者的治疗，取得一定的临床疗效。经典Wnt/β-catenin 信号通路在骨稳态平衡中发挥重要作用，其缺失或过度活化会导致骨量的骤降或激增[2-3]，是治疗PMOP 重要的分子靶点[4]。本实验通过金匮肾气丸干预去势骨质疏松小鼠模型，验证金匮肾气丸防治PMOP 的疗效，进一步探讨其对β-catenin 信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物 雌性10 周龄C57BL/6 小鼠24 只，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供[生产许可证号：SCXK（浙）2019-0008；使用许可证号：SYXK（浙）2019-0015]。小鼠饲养在湿度（40±5）%、温度（23±2）℃，昼夜12h 更替的环境下，可自由饮水和进食。本研究经浙江省宁波市鄞州区第二医院伦理委员会审核[审批号：（2019）伦审（31）号]。

1.2 药物及试剂 戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，批号921019），青霉素（规格：80 万单位，山东鲁抗医药股份有限公司，批号10121909073），4%多聚甲醛（Solarbio 公司，批号P1110），Alcian blue/hematoxylon（ABH）染液（Sigma 公司，美国，批号17372-87-1），Orange G 染液（Sigma 公司，美国，批号1936-15-8），核酸检测试剂盒（Takara 公司，日本，批号9534），金匮肾气丸（规格：72g/瓶，北京同仁堂，批号Z11020147）。

1.3 主要仪器 蔡司显微镜（Zeiss 公司，德国），Micro-CT（Skyscan 1170，Bruker 公司，比利时），骨形态计量仪（Osteometrics 公司，美国），荧光定量PCR仪（Termor 公司，美国）。

1.4 小鼠造模及分组 按照随机数字表法，将小鼠分成假手术组、模型组和金匮肾气丸组，每组8 只。造模方法：腹腔注射0.3%戊巴比妥（0.1mL/10g）麻醉后，常规皮肤剃毛消毒，于背部正中线作长约1.5cm的切口，沿背部肋弓缘、腰椎旁逐层进入腹腔，暴露两侧卵巢及输卵管。其中模型组和金匮肾气丸组摘除双侧卵巢及结扎输卵管；假手术组8 只，摘除双侧卵巢周围等量脂肪组织。检查无活动性出血，逐层缝合伤口。术后连续3 天腹腔注射青霉素（每次6 万，每天1 次）预防感染。

1.5 药物干预 术后观察3 天，所有小鼠均未出现切口感染或死亡，第4 天起开始药物干预。根据实验小鼠与成人的体表面积比例进行剂量换算[5]，每只小鼠（体质量按20g 计算）灌胃剂量为0.2mL/天。金匮肾气丸组小鼠予金匮肾气丸溶液（72g 肾气丸加热溶于100mL 蒸馏水中，继续加热浓缩至含生药1g/mL）0.2mL/天连续灌胃8 周。模型组小鼠给予等体积0.9%生理盐水灌胃，假手术组小鼠不作处理。

表1 小鼠Micro-CT 骨微结构参数比较（）

表1 小鼠Micro-CT 骨微结构参数比较（）

注：假手术组予切除等量脂肪组织；模型组予切除双侧卵巢；金匮肾气丸组予切除双侧卵巢+金匮肾气丸灌胃；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

1.6 Micro-CT 扫描分析 造模8 周后，摘取小鼠左侧股骨，剔除周围软组织，置于Micro-CT 进行扫描检测。扫描参数为：分辨率4000×2672，铝板0.2μm，扫描层厚为10μm。骨微结构重点分析股骨干骺端松质骨的区域，具体检测参数为：骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁间距和骨小梁厚度。

1.7 样本制作 Micro-CT 扫描完成后，将股骨组织置于4%多聚甲醛中固定48h，随后进行脱钙、脱水及石蜡包埋处理，制作成3μm 厚度的石蜡切片。

1.8 特殊染色及定量分析 完成脱蜡复水后，将切片置于ABH 染液染色1h。0.3%盐酸酒精分化、1%氨水返蓝后，置于Orange G 染液浸洗1min。纯水清洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，透明树脂封片。使用骨形态计量仪对染色后的切片进行组织形态定量分析，包括骨小梁面积分数（%）、脂肪空泡面积比（%）和脂肪空泡直径（μm）。

1.9 聚合酶链式反应（qRT-PCR） 摘取小鼠右侧股骨，剔除周围软组织，PBS 清洗3 遍后，按照核酸检测试剂盒进行荧光定量PCR 检测β-catenin、锌指结构转录因子（Osterix），碱性磷酸酶（ALP）mRNA 表达情况。

2 结果

2.1 金匮肾气丸延缓PMOP 小鼠骨量流失 Micro-CT 检测分析显示，与假手术组比较，去卵巢后模型组小鼠股骨骨密度下降，骨结构破坏，骨小梁数量减少，间距增大（P 均＜0.05），提示去卵巢PMOP 小鼠模型建立成功；与模型组比较，金匮肾气丸组小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数目和骨小梁间距均显著改善（P 均＜0.05）。见表1。

2.2 金匮肾气丸改善PMOP 小鼠股骨远端骨髓腔结构 小鼠骨组织经ABH 染色后，骨小梁呈橘色，骨髓细胞呈紫色和脂肪空泡呈白色圆形。ABH 染色及骨组织形态计量分析结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠骨小梁结构稀疏，髓腔内骨髓细胞排列紊乱，出现大量脂肪空泡。骨面积分数减少，脂肪空泡面积比和直径变大（P 均＜0.05）；金匮肾气丸治疗后，小鼠股骨骨小梁明显增粗，髓腔内骨髓细胞数量增多且排列有序。骨面积分数增加，脂肪空泡面积及直径显著减小（P 均＜0.05）。见图1，表2。

图1 小鼠股骨病理（ABH 染色×100 倍）

表2 小鼠骨组织形态定量分析（）

表2 小鼠骨组织形态定量分析（）

注：假手术组予切除等量脂肪组织；模型组予切除双侧卵巢；金匮肾气丸组予切除双侧卵巢+金匮肾气丸灌胃；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

2.3 金匮肾气丸促进β-catenin 及其下游成骨基因表达 mRNA 定量检测分析结果显示，与假手术组比较，模型组β-catenin 及下游的成骨基因Osterix和ALP 表达显著下降（P 均＜0.05）；与模型组比较，金匮肾气丸干预8 周后，β-catenin、Osterix 和ALP的mRNA 表达明显改善（P 均＜0.05），见表3。

表3 β-catenin、Osterix 及ALP mRNA 定量分析（IOD/Area，）

表3 β-catenin、Osterix 及ALP mRNA 定量分析（IOD/Area，）

注：假手术组予切除等量脂肪组织；模型组予切除双侧卵巢；金匮肾气丸组予切除双侧卵巢+金匮肾气丸灌胃；β-catenin 为β 连环蛋白；Osterix 为结构转录因子；ALP 为碱性磷酸酶；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3 讨论

PMOP 是一类与干细胞分化异常相关的骨代谢性疾病[6-7]。干细胞具有自我更新及持续成骨分化的能力，在机体骨稳态维持中起关键作用。干细胞表面表达有雌激素受体，与雌激素特异性结合后，能促进干细胞向成骨细胞分化，抑制其成脂肪分化[8]。女性绝经后，雌激素水平下降，导致干细胞成骨-成脂分化异常，是PMOP 重要的细胞学发病机制。

根据中医“肾藏精主骨”理论，中医治疗PMOP重在“补肾”。《医经精义》指出，“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之合也”。现代研究发现，“肾藏精主骨”的科学内涵主要体现在通过补肾来调控干细胞的增殖分化状态，进而影响骨量和骨微结构[9-10]。金匮肾气丸是“补肾”的经典方剂，其干预PMOP 可能是通过调控干细胞的分化实现的。

β-catenin 作为一个肌肉骨骼分子调控开关，能够决定干细胞分化方向。经典Wnt 信号通路中，Wnt配体与细胞膜表面受体Frizzled 和LRP5/6 相结合，募集Disheveled 和Axin，破坏了稳定的四聚体结构，导致胞浆内β-catenin 堆积，经跨核膜转激活下游成骨靶基因表达[11]。转基因动物研究表明，β-catenin基因缺失会导致骨形成及骨矿化能力下降，出现严重的骨质疏松表型[12]。由此提示，β-catenin 是治疗骨质疏松症潜在的分子靶点。

本研究结果显示，模型组小鼠骨量较假手术组显著下降，骨微结构破坏明显，提示PMOP 小鼠模型成功建立。金匮肾气丸干预8 周后，PMOP 小鼠骨量丢失减少，证明金匮肾气丸能够有效防治去势小鼠PMOP 的发生。病理上，造模组小鼠骨小梁稀疏，髓腔内脂肪空泡堆积；金匮肾气丸治疗后，脂肪空泡数量显著减少，并且代替以正常的骨髓细胞及骨小梁，提示去势造模后，小鼠骨内存在干细胞成骨-成脂分化异常，而金匮肾气丸能够调控干细胞向成骨细胞分化，从而改善小鼠骨量丢失。Osterix 和ALP 是经典Wnt/β-catenin 信号通路下游的成骨靶基因。Osterix是MSCs 成骨分化的特异性转录调节因子，ALP 具有促进羟磷灰石沉积，能够反映成骨形成能力。qRTPCR 结果显示，去势造模后，小鼠股骨β-catenin 及下游Osterix 和ALP 的mRNA 表达明显减少，可能导致干细胞成骨分化减弱。金匮肾气丸能够激活βcatenin 信号通路，促进下游的Osterix 和ALP 靶基因的表达，影响MSCs 成骨-成脂分化，延缓去势小鼠骨量流失和骨微结构破坏。

综上所述，金匮肾气丸可能通过激活β-catenin信号通路及下游Osterix、ALP 成骨基因表达，进而调控干细胞成骨分化，防治去势小鼠骨质疏松。