基于UPLC指纹图谱的不同产地墨旱莲药材质量评价

曹斯琼，程学仁，孙冬梅，索彩仙，周湘媛，邱韵静，李国卫

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

墨旱莲别称旱莲草、金陵草、白花蟛蜞菊等，以原名鳢肠始载于《唐本草》[1]，为菊科植物鳢肠EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，野生为主，生于河边、田边或路旁，主产河南、安徽、广东、广西、江苏、山东等省区[2]。墨旱莲是常用中药之一，具有滋补肝肾、凉血止血的功效，用于肝肾阴虚、牙齿松动、须发早白[3]。近代药理学研究表明，墨旱莲有免疫调节、抗氧化、抗感染、抗骨质疏松、抗菌、调血脂[4-8]等活性作用。

墨旱莲含有三萜皂苷类、噻吩类、香豆素、黄酮类、生物碱等成分[9-12]。目前，2015年版《中国药典》墨旱莲药材项下仅对蟛蜞菊内酯单一化学成分进行含量测定，然而传统中药的疗效是多成分共同作用的结果，单一活性成分并不能准确反映药材整体的质量。本文采用超高效液相色谱法(UPLC)建立墨旱莲药材的指纹图谱，结合指纹图谱的相似度计算及化学计量学分析方法，评价不同产地的墨旱莲药材质量，为墨旱莲药材质量标准的提高提供科学依据。

1 仪器与材料

Waters H-Class超高效液相色谱仪(沃特斯公司)；Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)色谱柱；ME204E万分之一天平、XP26百万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

咖啡酸对照品(质量分数：99.7%，批号：110885-201703)、木犀草苷对照品(质量分数：94.9%，批号：111720-201609)、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品(质量分数：94.1%，批号：111894-201102)、蟛蜞菊内酯对照品(质量分数：99.6%，批号：111885-201403)均由中国食品药品检定研究院提供；3,4-二咖啡酰奎宁酸(质量分数：98.0%，批号：wkq17060705)由四川维克奇生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇为分析纯；乙腈、三乙胺、磷酸为色谱纯，水为超纯水。

18批墨旱莲药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为菊科植物鳢肠EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈为流动相A，磷酸缓冲液(含0.53%磷酸和0.8%三乙胺)为流动相B，梯度洗脱(0～3 min，11%～16%A；3～9 min，16%A；9～20 min，16%～20%A；20～34 min，20%A；34～40 min，20%～80%A)；流速：0.30 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：330 nm；进样量：1 μL。

表1 墨旱莲药材来源Table 1 sample source information of Eclipta Herba

2.2 对照品溶液的制备

精密称取蟛蜞菊内酯、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、木犀草苷和3,4-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加甲醇制得质量浓度分别为7.705、4.033、8.467、7.550、9.267 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取墨旱莲药材粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70%乙醇50 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用体积分数70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 UPLC指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液(M1)，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以蟛蜞菊内酯峰为参比峰，计算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液(M1)，按“2.1”项色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图，以蟛蜞菊内酯为参比峰，计算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取样品粉末(M1，过三号筛)6份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样分析，记录色谱图，以蟛蜞菊内酯峰为参比峰，计算得各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3%，表明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立与相似度评价

取18批墨旱莲药材样品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图。将18批药材指纹图谱cdf格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，将M1号样品的指纹图谱作为参照图谱，并进行全峰匹配，18批墨旱莲药材指纹图谱叠加图标定共有峰8个，以平均数法生成墨旱莲药材对照图谱，结果见图1、图2。各批样品的共有峰的“峰面积/称样量”见表3，各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步定为墨旱莲药材的指标成分群。经与对照品对照，确认1号峰为咖啡酸峰，2号峰为木犀草苷峰，5号峰为4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸峰，8号峰为蟛蜞菊内酯峰。因蟛蜞菊内酯峰分离效果好、出峰稳定，选定为参照峰。对18批墨旱莲药材进行相似度评价，18批样品除M8外，均在0.90以上，说明各批次间相似度良好，结果见表3。

360340320300280260240220200180160140120100806040200M18M17M16M15M14M13M12M11M10M9M8M7M6M5M4M3M2M10246810121416182022242628303234363840t/minU/mV

2.6 墨旱莲指纹图谱的化学计量学分析

2.6.1 聚类分析 采用SPSS20.0软件，以墨旱莲药材的8个共有峰的“峰面积/称样量”为变量，采用组间联接方法对18批墨旱莲药材进行聚类分析，结果见图3。可见，当判别条件距离为5时，18批墨旱莲药材被大致分为3类，M8药材成一类，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一类，其余的为一类，这与指纹图谱相似度评价的结果一致。

U/mV5040302010020181614121086420U/mV01020304010152025303505t/minAB

2.6.2 主成分分析 以药材的8个共有峰峰面积为变量进行主成分分析，以主成分特征值大于1为提取原则，根据表4的结果提取了2个主成分，累积贡献率达到84.952%，基本能代表原样本的信息。成分载荷矩阵的数值及符号代表变量在主成分当中的载荷，载荷越大，表明该化合物在药材主成分分析中作用越大。由表5可见，峰1、峰3、峰5对成分1的影响大，对应的成分为咖啡酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸；峰6、峰7、峰8对成分2的影响大，峰8为蟛蜞菊内酯，为2015年版《中国药典》含量测定指标。以上结果说明，影响墨旱莲药材质量的主要因素为酚酸类成分。酚酸类成分具有抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、调节血脂及保肝等多种生物活性[13-14]，这与墨旱莲的现代药理作用相关。

以表6中的主成分1、主成分2的得分分别为横、纵坐标，生成18个样品主成分得分图，可以看出：M8药材成一类，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一类，其余的为一类，与聚类分析及特征图谱相似度分析的结果均一致，结果见图4。

表2 18批墨旱莲药材指纹图谱共有峰峰面积测定结果Table 2 Results of common peak areas of specific chromatogram of 18 batches Eclipta Herba

表3 18批墨旱莲药材墨旱莲药材指纹图谱相似度评价

0510152025471812141511756161011291338M4M7M18M12M14M15M1M17M5M6M16M10M11M2M9M13M3M8Y

表4 特征值及方差分析Table 4 characteristic value and analysis of variance

表5 主成分载荷矩阵Table 5 Principal component load matrix

表6 主成分得分表Table 6 Component score table

2.0001.0000.000-1.000-2.000主成分24.0002.0000.000-2.000主成分1

3 讨论

墨旱莲中含有香豆草醚类、皂苷类成分，故选用0.53%磷酸和0.8%三乙胺缓冲液为流动相，色谱峰峰形最优，基线平稳。供试品溶液的制备分别考察了甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇的提取效果，结果70%乙醇的提取效果最优，能最大限度地提取墨旱莲药材的有效成分；通过对比回流和超声2种提取方式，发现提取方式对墨旱莲药材的提取率影响较大，回流提取明显优于超声提取，故选择回流提取；同时还考察了不同提取时间(30、60、90 min)，结果表明加热回流60 min的提取效果较好。

本研究对18批墨旱莲药材进行了相似度评价，结果显示18批样品除M8外，相似度均在0.90以上，说明各批次间相似度良好；并对共有峰峰面积进行聚类分析，结果显示18批墨旱莲药材被大致分为3类，M8药材成一类，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一类，其余的为一类，这与相似度评价的结果一致。利用主成分分析法，将8个共有峰变量降维为2个主成分变量，2个主成分能代表8个共有峰84.95%的信息，可将18批药材分为3类，与相似度和聚类分析的结果一致。

结合表6 综合得分分析结果，3种分析方法是基于药材质量把不同产地的墨旱莲药材分为3类：第1类为综合评分排名10～18的9批样品，分别为江苏3批，山东、安徽各2批，广西、广东各1批，该类样品质量较差，含量偏低；第2类为综合评分排名2～9的8批样品，分别为江苏3批，广东2批，安徽、河南、山东各1批，该类样品质量较优，含量较高，为《中国药典》规定值的2～5倍；第3类为综合评分排名第1的河南1批样品(M8)，该样品特征峰响应较其他批次样品高，其中影响主成分1的3个主要色谱峰为峰1、峰3、峰5，峰面积为其他批次的2.5倍以上，含量亦达到《中国药典》规定值的3.8倍，质量最好。综上，本研究中河南产地的墨旱莲药材排名均在前十，质量最优；广东产地的大部分药材排名靠前，质量次之；广西产地的药材排名靠后，质量较差；江苏、山东、安徽的药材质量呈现两头分布，说明这3个产地的药材质量不稳定。

本研究所建立的墨旱莲药材UPLC指纹图谱分析方法方便快捷、专属性强，可为墨旱莲药材质量评价提供科学的方法，并为优选墨旱莲药材产地提供了实验依据。