岩藻多糖的抗氧化功能研究进展

徐元庆，王哲奇，张 静，范依霖

内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018

岩藻多糖，也称褐藻多糖、褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖胶等。岩藻多糖是一种独特的水溶性硫酸化多糖，主要存在于多种褐藻的细胞外基质和几种海洋无脊椎动物中，是褐藻细胞外基质中的主要成分，具有多种生物活性。在过去的数十年中，从不同褐藻和几种海洋无脊椎动物中分离出的岩藻多糖因其多种生物活性而受到广泛关注和研究，包括抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、降血脂、抗氧化等活性[1]。由于高可用性和功能特性，特别是其所具有的抗氧化特性，岩藻多糖被广泛用作化妆品、功能食品、膳食补充剂以及水产养殖和牲畜饲料补充剂中的活性成分。本文总结了岩藻多糖的结构和抗氧化活性及其抗氧化活性调控机制的研究进展。

1 来源和分子结构

岩藻多糖是一种天然的硫酸化多糖，广泛分布在褐色海藻的细胞壁基质中[2]，主要功能是充当细胞壁中半纤维素和纤维素之间的交联剂，以保持细胞的完整性[3]。包括Adenocystisutricularis[4]、Chordafilum[5]、Cladosiphonokamuranus[6]、Dictyotamenstrualis[7]、Fucusevanescens[8]、Fucusvesiculosus[9]、FucusdistichusL.[10]、FucusserratusL.[11]、Hizikiafusiforme[12]、Laminariajaponica[13]、Laminariacichorioides[14]、Lobophoravariegata[15]、Padinagymnospora[16]、Stoechospermummarginatum[17]、Sargassumstenophyllum[18]和Undariapinnatifida[19]等。此外，这种生物聚合物也存在于一些海洋无脊椎动物中，如海参Ludwigothureagrisea[20]或海胆Lytechinusvariegatus[21]、Echinometralucunter[21]、Arbacialixula[21]、Strongylocentrotuspallidus[22]和Strongylocentrotusdroebachiensis[22]等。

岩藻多糖是异源的且是结构相关多糖的混合物，其具有碳水化合物单元和非碳水化合物取代基含量的某些变化[1]。通常，岩藻多糖的化学结构复杂，主要由L-岩藻糖和硫酸盐残基组成。此外，它们还含有其他单糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖或糖醛酸等成分，甚至还含有乙酰基和蛋白质[6,11]，但所有这些都占岩藻糖苷总结构的10%以下。对于含有大量糖醛酸和己糖的岩藻多糖，结构核心可以由交替的糖醛酸-己糖构建，因为这种结构非常稳定，其他单糖主要存在于核心的分支中[16]。岩藻多糖是一种聚阴离子硫酸化多糖，根据Cumashi等[1]的说法，岩藻多糖中的多糖主链被称为I型链或II型链(图1)，I型链含有重复的(1→3)连接的α-L-吡喃岩藻糖残基，而II型链含有交替的(1→3)和(1→4)连接的α-L-吡喃岩藻糖残基。Chordafilum和Eckloniakurome中的岩藻多糖呈现(1→3)连接的吡喃葡萄糖的结构特征[5,23]。从Hizikiafusiforme中分离出的岩藻多糖主要是岩藻糖，半乳糖，甘露糖，木糖和糖醛酸组成，硫酸盐含量为21.8%，而一些岩藻糖具有两个硫酸根[12]。根据主链的结构，岩藻多糖可以在岩藻糖残基的C-2位、C-4位或两个位置处被硫酸化，偶尔也位于C-3位。

图1 岩藻多糖的I型链和II型链Fig.1 Type I and type II chains of fucoidan注：R是碳水化合物(α-L-岩藻糖基、α-D-葡萄糖醛酸)和非碳水化合物(硫酸盐和乙酰基)取代基的潜在附着物。Note:R is potential attachment of carbohydrate (α-L-fucopyranose,α-D-glucuronic acid) and non-carbohydrate (sulfate and acetyl groups) substituents.

岩藻多糖结构和单糖组成根据不同因素而变化，例如岩藻多糖的来源，收获时间和收获地点以及提取方法，都影响岩藻多糖的结构和生物活性。

不同来源的岩藻多糖具有不同的结构和单糖组成。Feng等[24]采用超声辅助水提法，从Laminariajaponica和UndariapinnatifidaSuringar提取多糖，L.japonica主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和核糖组成，且主成分为甘露糖；U.pinnatifida主要由甘露糖、半乳糖、木糖和核糖组成，且主成分为半乳糖。从Chordafilum分离的岩藻多糖含有高度支化的(1→3)-吡喃葡萄糖残基骨架。从Eckloniakurome中分离出的岩藻多糖部分具有高度支化的结构，其主链也是(1→3)-L-吡喃葡萄糖残基，硫酸基主要附着于C-4位[23]。然而，在一些褐色海藻中也可以发现(1→2)或(1→4)连接的吡喃葡萄糖残基骨架。Himanthalialorea和Bifurcariabifurcata的岩藻多糖具有(1→2)-和(1→3)-连接的吡喃葡萄糖残基，在C-4处具有硫酸化作用。来自Stoechospermummarginatum的岩藻多糖具有(1→3)-(和1→4)-连接的α-L-吡喃葡萄糖残基骨架，并且主要在C-2和(或)C-4处被硫酸化[17]。从Ascophyllumnodosum中纯化的岩藻多糖部分由高度支化的核心区组成，主要含有α-(1→3)-吡喃葡萄糖残基和少量α-(1→4)-吡喃葡萄糖残基，硫酸盐基团位于C-2位和(或)C-4位[25]。

相同的特定褐色海藻可能产生不同结构的岩藻多糖。Duarte等[18]报道，Sargassumstenophyllum生物合成了两组不同的岩藻多糖。其中之一的特征是较高百分比的糖醛酸和较少的硫酸基团，其位于不同的岩藻糖残基上，岩藻糖是主要成分，但其他单糖如半乳糖，甘露糖，糖醛酸，葡萄糖和木糖含量也较大。另一种岩藻多糖含有少量的糖醛酸和高百分比的硫酸盐基团，它们集中在岩藻糖残基上，只有岩藻糖和半乳糖作为主要成分。

相同的特定褐色海藻不同的采集时间可能具有不同结构的岩藻多糖。采用氯化钙萃取法，对Undariapinnatifida进行了岩藻成分和含量的研究。从2011年7月至10月从U.pinnatifida中每月提取粗岩藻多糖。从7月到9月，提取的岩藻多糖中硫酸基含量增加了2倍以上，而岩藻糖含量保持不变[19]。U.pinnatifida孢子体来源的岩藻多糖中硫酸盐的含量从7月至9月增加，然后在10月下降。叶片衍生的岩藻多糖的硫酸盐含量在7月至9月之间也显著增加，然后在10月显著下降。从7月到9月，孢子囊岩藻多糖的硫酸盐含量显著增加了2倍以上。这些结果表明，Undariapinnatifida的成熟可能直接影响岩藻多糖中硫酸盐基团的数量，尤其是孢子囊中的硫酸盐基团的数量[19]。这些结果与Honya等[13]报道的结果一致，显示了Laminariajaponica中岩藻多糖硫酸盐含量变化的相似趋势，其中硫酸盐的摩尔比随着藻类的成熟(4～9月)而增加，9月份叶片中糖醛酸含量的陡增很可能是由于如孢子囊形成和叶片轻微腐烂等新陈代谢发生变化所致。

相同的特定褐色海藻不同的部位可能具有不同结构的岩藻多糖。U.pinnatifida叶状体和孢子叶部分的产量各不相同，其中孢子叶的含量最高。对岩藻多糖的岩藻糖含量进行测定后发现，U.pinnatifida叶片衍生岩藻多糖在7月至10月之间显著下降，孢子囊来源的岩藻多糖中的岩藻糖含量则保持不变[19]。类似的，Skriptsova等[26]报道，U.pinnatifida在孢子发生过程中，孢子囊来源的岩藻多糖的岩藻糖含量也没有显著变化，叶片的降解可能是源自叶片的岩藻多糖中岩藻糖含量下降的原因。从7月到9月，孢子囊岩藻多糖的硫酸盐含量显著增加了2倍以上，叶片衍生的岩藻多糖的硫酸盐含量则保持不变[19]。但是，U.pinnatifida叶状体成熟形成孢子囊时，中性糖的组成会发生变化，甘露糖含量随孢子囊的生长而下降4.7倍，半乳糖含量从27.0 mol%上升至42.8 mol%，岩藻糖和半乳糖的摩尔比从1∶0.51变为1∶0.80[26]。Lee等[27]和Mak等[19]从U.pinnatifida的孢子叶中提取的岩藻多糖分子量分别约为9 kDa和171 kDa，而从U.pinnatifida全叶中提取的岩藻多糖的分子量则为710 kDa[28]。此外，从Lessonianigrescence的根部和茎部提取粗岩藻多糖，2种多糖均是以岩藻糖为主要单糖，木糖和半乳糖含量较高的硫酸化岩藻多糖，但根部中甘露糖醛酸含量高达73%，明显高于茎部的61%，且其硫酸盐基团分别主要在C4和C2/C3位上[29]。这就表明，褐色海藻不同部位的岩藻多糖的含量和结构有所不同。

通过不同方法提取和纯化的岩藻多糖也可能具有不同的结构。岩藻多糖是水溶性多糖，故岩藻多糖的提取多用传统的水提取法和酸提取法，提取温度和所用溶剂都会影响岩藻多糖的组成和结构。在不同温度条件(90～150 ℃)下提取Ascophyllumnodosum中的岩藻多糖，在90 ℃提取的岩藻多糖的主要单糖是岩藻糖，而在150 ℃时提取的岩藻多糖的主要单糖是葡萄糖醛酸，且随着萃取温度的降低，岩藻多糖的分子量和硫酸盐含量均增加[30]。Ponce等[4]也报道，在室温下提取的Adenocytisutricularis的岩藻多糖主要由岩藻糖，半乳糖和硫酸酯组成。在70 ℃提取的岩藻多糖主要由岩藻糖组成，伴有其他单糖(主要是甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖和半乳糖)，大量的糖醛酸和低比例的硫酸酯。在较高的温度下较长的提取时间会导致较高的多糖提取率，而岩藻糖含量和硫酸盐含量随时间延长而下降，而葡萄糖醛酸的比例较高[4,18]。同样在70 ℃的提取温度下，以蒸馏水、2%氯化钙溶液和稀盐酸(pH=2)溶液作为溶剂，同样获得不同组分和结构的岩藻多糖，与氯化钙溶剂相比，利用稀盐酸进行萃取，多糖提取率较高，且具有较高的蛋白质、糖醛酸、甘露糖和葡萄糖含量，但具有较低的硫酸盐含量和较大的分子量[4]。Shan等[31]分别采用稀盐酸法和氯化钙法提取岩藻多糖并进行理化性质分析和比较，也发现稀盐酸法提取岩藻多糖提取率显著高于氯化钙法，但所得岩藻多糖的硫酸基含量和绝对分子量都明显降低。因为盐酸可能引起细胞壁基质的松散，从而使酸局部渗入岩藻多糖，造成多糖主链断裂及硫酸基脱落，破坏岩藻多糖的结构。此外，超声波提取法、酶辅助提取法、微波辐照提取法等新型方法利用超声波、酶和微波破坏细胞壁的骨架结构，促使细胞内的活性成分岩藻多糖流出，缩短提取时间且反应条件温和而广受关注。与热水提取法比较，超声辅助提取海带岩藻多糖，能够增加多糖提取率，岩藻糖和硫酸基含量也更高，这是由于较高的温度会在一定程度上破坏多糖分子结构，降低其硫酸基含量。Guo等[32]利用超声波对海参中岩藻多糖进行处理后，岩藻多糖的分子量明显降低，线性四糖重复单元保持为原始多糖，中间的非硫酸化岩藻糖单元被轻微破坏。Choi等[33,34]利用γ射线对岩藻多糖进行辐射处理，能够显著提高岩藻多糖分子中羟基和不饱和键的含量，硫酸盐含量保持不变，但岩藻多糖的分子量随着γ辐照剂量的增加而下降，因为具有较高分子量的岩藻多糖由于辐射产生的自由基发生分裂的可能性更高而被更严重地降解。

基于岩藻多糖来源和结构的复杂性及多种生物学活性，近些年已对其进行了广泛的生物学研究以探究其所具有的生物学特性，例如抗氧化活性。

2 抗氧化活性

正常生理过程中，机体会产生一定量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，适量的ROS参与机体的信号传导、细胞分裂、免疫应答和细胞自噬等正常生理过程。然而，当机体受到不利刺激时，ROS就会过量产生，或其清除能力受阻，导致机体抗氧化系统失衡，从而导致氧化应激[2]。这会导致许多健康问题，如癌症，糖尿病，严重组织损伤的神经退行性疾病和炎症性疾病等。近年来，从多种海藻和一些海洋无脊椎动物中分离出的岩藻多糖已被证明是潜在的ROS清除剂。

2.1 体外抗氧化活性

体外细胞试验也表明岩藻多糖具有良好的抗氧化活性。Chale-Dzul等[39]发现岩藻多糖表现出良好的对HepG2细胞中ROS的清除活性，而且它们还增加了谷胱甘肽(GSH)水平并恢复了H2O2对过氧化氢酶(CAT)活性的抑制。岩藻多糖能够逆转H2O2对大鼠PC12细胞中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的抑制，从而清除H2O2诱导的PC12细胞中ROS的形成并降低丙二醛(MDA)的含量[40]。此外，岩藻多糖增强了人HaCaT细胞中抗氧化剂血红素加氧酶-1(HO-1)和SOD1的基因表达和蛋白表达，从而发挥抗氧化活性[41]。在H2O2处理的猪肠上皮细胞系(IPEC-1)中，岩藻多糖使GPx活性和GSH含量以及醌氧化还原酶1(NQO1)和SOD1的基因表达正常化，同时防止产生过量的MDA，从而抑制H2O2诱导IPEC-1的坏死增加[42]。

提取方法也会影响褐藻岩藻多糖的抗氧化活性。Imbs等[47]使用热酸法和无水CaCl2法2种方法从Fucusevanescens中提取岩藻多糖，热酸法提取的岩藻多糖和无水CaCl2法提取的岩藻多糖，硫酸根的质量分数分别为9.0%和40.3%，岩藻糖的质量分数分别为59.4%和90.0%。在浓度为1.0 mg/mL时，热酸法提取的岩藻多糖和无水CaCl2法提取的岩藻多糖的DPPH自由基清除率分别为57.6%和19.4%。因此，提取方法不同，导致岩藻多糖化学组成不同，从而会对其抗氧化活性产生影响。

此外，岩藻多糖的组成影响其抗氧化活性。L-岩藻糖难以被ROS降解，不具有清除ROS的能力。然而，ROS容易与半乳糖、甘露糖和糖醛酸反应，裂解糖苷键并氧化糖醛酸，然后岩藻多糖通过还原反应清除ROS，据此得出，半乳糖、甘露和糖糖醛酸含量(比例)对ROS具有明显的清除作用[55]。

综合而言，岩藻多糖的来源，提取方法，分子量、组分和硫酸基团的含量和位置等都可能影响岩藻多糖的抗氧化活性。

2.2 体内抗氧化活性

目前，关于岩藻多糖的抗氧化活性研究主要集中在大鼠和小鼠模型上，多种研究发现，通过口服或注射一定剂量的岩藻多糖对衰老、肥胖、胃肠损伤、肝损伤、创伤性脑损伤、缺血-再灌注损伤、肾病、高草酸尿症、帕金森病、糖尿病和关节炎等损伤或疾病具有增强抗氧化功能(表1)。岩藻多糖的给药方式以口服或灌胃为主，给药剂量为10～500 mg/kg。部分研究通过腹腔注射给药，给药剂量为12.5～400 mg/kg。少量研究通过皮下注射给药，给药剂量为5 mg/kg。绝大多数研究都发现，在各种疾病或损伤动物模型中，不管以何种给药方式，岩藻多糖都会通过增强抗氧化酶活性(包括CAT、SOD、GPx、GR)和非酶抗氧化剂的含量(特别是GSH)来增强机体的抗氧化功能。但需要特别指出的是，同样在IRI的动物模型中，腹腔注射岩藻多糖降低了大鼠脑组织的SOD活性[56]，却增加了小鼠肾脏组织的SOD活性[57]。另外，在完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠模型中，通过灌胃给药岩藻多糖降低了血清中CAT、POD和SOD活性[2]，作者推测这可能是岩藻多糖进入机体内会直接清除体内产生的ROS，从而降低内源性抗氧化酶的表达，但这种推论需要进一步的分子研究以明确其确切的机制。

表1 岩藻多糖的体内抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of fucoidan in vivo

续表1 (Continued Tab.1)

2.3 体内抗氧化活性调控机理

2.3.1 Keap1-Nrf2-ARE调控途径

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)-核转录因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路是机体抵抗氧化应激关键的防御性转导通路。通常，在不受应激的细胞中，抑制蛋白Keap1与Nrf2形成复合物，从而将Nrf2隔离在细胞质中，使其无法进入细胞核导致转录活性被抑制。

然而，当细胞暴露于轻度的氧化应激时，Nrf2在Nrf2的特定丝氨酸和(或)苏氨酸残基处被磷酸化，从Keap1上解离并转移到细胞核中[88]，与ARE结合并启动下游一系列保护基因如抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶等转录基因的表达，包括HO-1、NQO1、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、GPx、SOD、CAT等大量保护性基因的转录，增加细胞对ROS的清除能力[89,90]。研究发现，岩藻多糖可通过上调Nrf2增强机体抗氧化功能(图2)。岩藻多糖在二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化大鼠中显著增加Nrf2及其下游通路介质(包括NQO1、HO-1、SOD和GST)的基因和蛋白质表达[74]。尽管H2O2处理上调了IPEC-1中Nrf2的表达，但岩藻多糖进一步增强了Nrf2的表达，并上调了氧化应激状态下游靶基因NQO1、SOD1和GPx1的基因表达水平，降低了MDA水平[42]。另外，动物试验上的研究也发现，尽管乙酰氨基酚(APAP)孵育后诱导了小鼠肝细胞核Nrf2表达，岩藻多糖进一步增强细胞核中的Nrf2和总的Nrf2表达，并降低肝脏组织中ROS和MDA的水平，同时增加SOD、CAT的活性及GSH含量[72]。研究还发现，岩藻多糖可通过激活人肺成纤维细胞中的Nrf2信号通路来防止氧化损伤[91]。另外，Nrf2一般仅存在于细胞的细胞质中，但是在岩藻多糖处理后的HaCaT细胞观察到Nrf2在细胞核中积累，表明岩藻多糖促进了Nrf2从细胞质向细胞核内的转运，并降低Keap1的细胞质稳定性[41]。同样的结果也发现于IPEC-1细胞的试验中，岩藻多糖促进了Nrf2在易受氧化应激的IPEC-1细胞中向核的转运[42]。这就表明岩藻多糖不仅调控Nrf2的表达，同样也调控其从细胞质向细胞核的转移。综合以上结果表明，岩藻多糖的抗氧化生物学功能机制与Nrf2信号的激活有关。

图2 岩藻多糖的抗氧化作用机理Fig.2 Antioxidant mechanism of fucoidan

2.3.2 MAPK调控途径

氧化应激会激活MAPK(p38、JNK和ERK)途径，并引起p38、ERK和JNK的磷酸化水平的急剧增加，但岩藻多糖能够通过调控MAPK途径调控机体的抗氧化机能(图2)。岩藻多糖处理成肌细胞(C2C12细胞)后，p38、ERK和JNK基因的表达降低，随着岩藻多糖浓度(1、10和100 μg/ml)的增加导致C2C12细胞中的ERK磷酸化和JNK磷酸化水平进一步降低，并调控MnSOD、CAT、GPx和GR的基因表达，从而并调控ROS的产生[92]。另外，来自Undariapinnatifida岩藻多糖抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中MAPK(p38、ERK和JNK)的磷酸化，从而阻断ROS的产生[93]。此外，ERK的特异性抑制剂可通过抑制ERK磷酸化来减少磷酸化Nrf2的积累，表明Nrf2是ERK的直接下游靶标。所以，ERK信号传导可诱导Nrf2活化并调节细胞对氧化应激的保护作用。最近的一项研究报道也表明，岩藻多糖通过ERK-Nrf2信号介导的HaCaT细胞中HO-1和SOD1的表达降低了氧化应激[41]。岩藻多糖还抑制了ARPE-19细胞中的Ca2+注入和ERK磷酸化表明其通过经由依赖Ca2+的ERK信号传导途径使ROS生成正常化而保护ARPE-19细胞免受高葡萄糖诱导的氧化损伤[94]。

2.3.3 TLR-NF-κB和PI3K-Akt调控途径

虽然没有直接的证据证明，但我们推测岩藻多糖可以通过TLR-NF-κB途径发挥抗氧化功能(图2)。TLR是进化上保守的模式识别受体(I型跨膜蛋白)，能够识别细菌，病毒和一些其他病原体中的代谢物[95]。TLR被多种刺激激活并触发细胞内信号转导，例如NF-κB。激活的TLR通过其受体域与通用细胞质衔接分子-髓样分化初级反应88(MyD88)相关联。随后，激活的MyD88激活了能够诱导IκB抑制剂磷酸化的IKK复合物。IκB的磷酸化释放出细胞质的NF-κB二聚体使它们能够转移到细胞核中，从而调节多种相关基因的表达，如SOD[96]。研究发现，岩藻多糖预孵育抑制了巨噬细胞MyD88的蛋白表达水平，减少IKK-α、IκB-α、NF-κB亚基p50和p65的磷酸化以及p50和p65的核易位[97]。Jang等[98]也证实岩藻多糖可以防止LPS刺激的RAW 264.7细胞中IκB-α降解，随后抑制NF-κB易位至细胞核中。此外，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)也通过差异调节NF-κB转录活性。在巨噬细胞中，PI3K-Akt通过诱导其磷酸化使糖原合酶激酶-β(GSK-β)失活，然后抑制NF-κB的反式激活活性。岩藻多糖显著抑制了Akt的磷酸化和p65的活性。因此，岩藻多糖可抑制PI3K-Akt通路抑制NF-κB的活性。

3 总结

岩藻多糖是海藻中广泛存在的重要硫酸化多糖之一，岩藻多糖结构和在多种海藻中的含量是复杂和不均匀的，然而，其生物活性非常具有吸引力。有充分证据表明，岩藻多糖对氧化应激表现出显著的抑制作用，其抗氧化活性依赖于多种细胞和分子机制，包括Keap1-Nrf2-ARE途径、MAPK途径、TLR-NF-κB途径和PI3K-Akt途径等。然而，作为一种组分复杂的多糖混合物，岩藻多糖纯化工艺复杂且难度较大，加之混合物的异质性使其各组分作用机理难以研究和多糖分子太大而不能用作药物。然而，通过水解制备保留了抗氧化特性的低分子量岩藻多糖用作药物治疗慢性疾病是未来的研究方向。目前，基于岩藻多糖来源丰富和具有多种生物活性的特性，其可用作膳食补充剂或保健食品以延迟或预防多种慢性疾病，或在畜牧生产中用作促进畜禽生长和健康的饲料添加剂。