山东省铁线莲属植物镇痛抗炎作用的试验评价

杨守娟

（山东中医药高等专科学校，山东 264199）

威灵仙收录于2015 版《中国药典》，具有祛风除湿、通络止痛之功，用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利，骨哽咽喉等症［1］。《本草纲目》中记载“威言其性猛也，灵仙言其功效”。本品辛散而通，性急善走，能宣通五脏、十二经络，故通络止痹痛效果强［2］。现代药理研究表明，威灵仙水煎剂有镇痛消炎作用［3］，可治疗风湿性关节疼痛。威灵仙的化学成分有皂苷类化合物、黄酮化合物、挥发油等，药理作用有抗癌活性［4］、抗炎镇痛活性［5，6］、抗菌活性［7］。威灵仙在2015 版《中国药典》中只收载3 个品种为正品来源，即毛茛科植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck、东北铁线莲Clemati s manshuricaRupr、棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall的干燥根及根茎。而毛茛科铁线莲属植物在山东分布广，品种较多，资源丰富，主要有褐紫铁线莲（Clematis fuscaTurcz）、威 灵仙（C.chinensisOsbeck）、棉团铁线莲（Clematis haxapetalaPall）、太行铁线莲（Clematis kirilowiiMaxim）、大叶铁线莲（Clematis heracleifoliaDC）、毛果扬子铁线莲 [Clematis ganpiniana（Levl.et Vant.）Tamura Var.tenuisepala（Maxim.）C.T.ting]、烟 台山蓼（Clematis haxapetalaPall. var.tchefouensisS.Y.Hu）等品种［8］，分布于山东各大山区，如崂山、艾山、泰山等。在民间，这些品种在用法上与威灵仙相似，用于治疗头、胃、腹肌及关节疼痛。本课题以小鼠热板法、冰醋酸所致小鼠扭体法研究山东省分布的铁线莲属植物的镇痛作用；以二甲苯诱导小鼠耳肿胀研究其抗炎作用，对铁线莲属植物的药效作用进行比较研究，旨在控制中药的质量，辨别药材的真伪，保证临床用药的有效性和安全性；同时扩大药源，促进新药开发。

1 材料与仪器

1.1 试验动物 清洁级昆明种小鼠，体质量18 ～21 g，合格证号：1902048，由烟台大学实验动物中心提供。

1.2 试验试剂 二甲苯（天津市科密欧化学试剂有限公司），冰醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 试验仪器 数显恒温水浴锅（上海力辰邦酉仪器科技有效公司），上海沙逊机械秒表504 田径运动比赛科学试验计时器，日本岛津AUW220D 数显电子分析天平（0.1 mg）。

1.4 试验药品 威灵仙（C.chinensisOsbeck，购于山东中医药高等专科学校药房）；褐紫铁线莲（Clematis fuscaTurcz）、大叶铁线莲（Clematis heracleifoliaDC）、毛果扬子铁线莲[Clematis ganpiniana（Levl.et Vant.）Tamura Var.tenuisepala（Maxim.）C.T.ting]、 烟台山蓼（Clematis haxapetalaPall. var.tchefouensisS.Y.Hu）的干燥根和根茎，采自山东崂山。上述药材经山东中医药高等专科学校王兴顺老师鉴定为正品。

1.5 药液制备 取药材粗粒，加10 倍量蒸馏水浸泡30 min 后煎煮，沸后用文火煮60 min，滤出煎液；药渣加8倍量水，沸后文火煮60 min，滤出煎液，合并滤液，70 ℃浓缩至规定量。

1.6 给药剂量的设计 按照《药理实验方法学》中人与动物体表面积折算的等效剂量设计给药剂量［9］。威灵仙按照2015 版《中国药典》规定剂量换算成小鼠等效剂量，相当于本试验的小剂组，即0.74 g/ml；褐紫铁线莲、大叶铁线莲、毛果扬子铁线莲、烟台山蓼设两个剂量组，即与威灵仙等剂量的小剂组0.74 g/ml 和3 倍量的大剂组2.22 g/ml。

2 试验方法

2.1 小鼠热板镇痛试验 按文献法［9，10］调节恒温水浴，水温恒定在（55±0.5）℃，将500 ml 烧杯放入其中，使烧杯底部接触水面。每次取雌性小鼠1 只，放入烧杯内。记录自放入烧杯至出现舔足所需时间（秒），作为该鼠的痛阈值。凡30 s 内不出现舔足者，弃之不用。依次测量各小鼠的痛阈值。取预选合格（痛阈值在5～30 s）的昆明种雌性小鼠100 只，随机分为10 组，即生理盐水组、威灵仙煎剂组、试验药材大剂组、试验药材小剂组，每组10 只。各组灌胃1 次/d，1 ml/次，连续3 d。

检测指标：与末次给药后的30、60、90 和120 min测定各鼠痛阈值。若小鼠在热板上60 s 仍无痛觉反应，应取出，按60 s 计。结果记录表内，按不同时间测定的各小鼠痛阈平均值计算用药后痛阈提高的百分率。痛阈提高值=(给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值)，痛阈提高值为负数时，按0 计。统计方法：计量资料采用t检验观察其组间差异。

2.2 冰醋酸扭体试验 取昆明种小鼠100 只，雌雄各半，随机分10 组，每组10 只，分组同上，每日灌胃1次，每次1 ml，连续3 日，于末次给药后60 min，各鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 ml/只。

检测指标：观察并记录注射醋酸溶液后15 min 内出现扭体反应（腹部收缩内凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行）的次数及时间。计算药物的镇痛百分率。镇痛率=（对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/对照组平均扭体次数×100%。统计方法：计量资料采用t检验观察其组间差异。

2.3 二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀试验 按文献法［9，10］将昆明种小鼠100 只，雌雄各半，随机分成10 组，每组10 只，分组同上。各组灌胃1 次/d，1 ml/次，连续3 d，末次给药后60 min，于小鼠左耳两面涂100%二甲苯0.1 ml/只致肿胀，右耳不涂为正常耳。

检测指标：4 h 后脱颈椎处死小鼠，用8 mm 打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片，于分析天平上称重。左耳重量减去右耳重量为肿胀度，按以下公式计算：抑制率（%）=（对照组肿胀度-给药组肿胀度）/对照组肿胀度×100%。统计方法：计量资料采用t检验观察其组间差异。

2.4 统计学方法数据分析 用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用+s表示，计数资料采用Ridit 检验。

3 结果

3.1 对热板致小鼠镇痛的影响 与生理盐水组比较，各组的给药前痛阈无差异，说明分组均匀；第30、60、90 和120 min 时，威灵仙、大剂褐紫铁线莲组、大剂大叶铁线莲组、大剂毛果扬子铁线莲组痛阈值有显著提高（P＜0.05）；且与威灵仙组比，大剂褐紫铁线莲组、大剂大叶铁线莲组、大剂毛果扬子铁线莲组痛阈值无差异（P＞0.05）。说明大剂的褐紫铁线莲、大叶铁线莲、毛果扬子铁线莲与常规剂量的威灵仙具有相似的镇痛效果。见表1。

表1 山东省铁线莲属植物水煎液对热板致小鼠痛阈提高值的影响（n=10，±s）s

表1 山东省铁线莲属植物水煎液对热板致小鼠痛阈提高值的影响（n=10，±s）s

注：与生理盐水组比较，*P ＜0.05；药后与威灵仙组比较，#P ＞0.05

组别 给药前痛阈 药后痛阈提高值药后30 min 药后60 min 药后90 min 药后120 min生理盐水组 12.48±2.12 0.41±2.19 0.64±2.22 1.5±2.19 1.00±2.28威灵仙组 12.36±2.08 11.12±2.31* 12.22±2.27* 13.12±2.72* 10.10±0.81*大剂褐紫铁线莲组 12.56±2.41 9.92±2.36*# 10.91±2.63*# 12.03±2.43*# 7.92±2.19*#小剂褐紫铁线莲组 12.38±2.51 2.01±2.26 3.10±2.13 4.18±2.23 2.18±2.36大剂大叶铁线莲组 12.23±2.55 10.25±2.07*# 14.29±2.18*# 15.35±2.25*# 10.45±2.26*#小剂大叶铁线莲组 12.62±2.28 0.94±2.23 2.76±2.51 1.87±2.61 0.84±2.13大剂毛果扬子铁线莲组 12.58±2.38 9.9±2.25*# 12.91±2.38*# 13.59±2.26*# 10.9±2.16*#小剂毛果扬子铁线莲组 12.69±2.46 2.32±2.16 3.79±2.36 4.69±2.69 0.79±2.31大剂烟台山蓼组 12.66±2.71 2.62±2.32 3.46±2.27 4.85±2.05 0.83±2.23小剂烟台山蓼组 12.86±2.19 1.6±2.09 1.62±2.63 1.72±2.67 0.12±2.63

3.2 抑制冰醋酸致小鼠扭体反应试验结果 与生理盐水组比，威灵仙、大剂褐紫铁线莲组、大剂大叶铁线莲组、大剂毛果扬子铁线莲组可明显降低小鼠扭体次数（P＜0.05）；且与威灵仙组比，大剂褐紫铁线莲组、大剂大叶铁线莲组、大剂毛果扬子铁线莲组小鼠扭体次数无差异（P＞0.05）。也就是说大剂的褐紫铁线莲、大叶铁线莲、毛果扬子铁线莲与常规剂量的威灵仙具有相似的镇痛效果。 见表2。

表2 对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s）

表2 对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s）

注：与生理盐水组比较，*P ＜0.05；与威灵仙组比较，#P ＞0.05

组别 小鼠（只） 扭体次数 镇痛率（%）生理盐水组 10 48±16 -威灵仙组 10 30±10 37.5*大剂褐紫铁线莲组 10 33±9 31.2*#小剂褐紫铁线莲组 10 42±11 12.5大剂大叶铁线莲组 10 34±10 29.2*#小剂大叶铁线莲组 10 38±8 20.8大剂毛果扬子铁线莲组 10 32±7 33.3*#小剂毛果扬子铁线莲组 10 40±12 16.7大剂烟台山蓼组 10 39±10 18.8小剂烟台山蓼组 10 42±7 12.5

3.3 抑制二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀试验结果 与生理盐水组比，威灵仙、大剂褐紫铁线莲组、大剂大叶铁线莲组、大剂毛果扬子铁线莲组均可明显降低小鼠耳廓肿胀度，提高抑制率（P＜0.05）。 见表3。

表3 对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀反应的影响（±s）

表3 对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀反应的影响（±s）

注：与生理盐水组比较，*P ＜0.05

组别 小鼠（只） 肿胀度（%） 抑制率（%）生理盐水组 10 8.52±2.85 -威灵仙组 10 3.27±1.52 61.6*大剂褐紫铁线莲组 10 5.35±1.41 37.2*小剂褐紫铁线莲组 10 6.69±1.59 21.5大剂大叶铁线莲组 10 4.98±1.98 41.9*小剂大叶铁线莲组 10 7.06±2.06 17.1大剂毛果扬子铁线莲组 10 5.51±1.87 35.3*小剂毛果扬子铁线莲组 10 7.85±2.18 7.8大剂烟台山蓼组 10 7.65±2.63 10.2小剂烟台山蓼组 10 7.98±2.10 6.3

4 讨论

许多中药为多来源品种，对亲缘关系相近的品种进行相应药效学研究，以控制中药的质量，辨别药材的真伪，为保证临床用药的有效性和安全性提供理论依据。以其扩大药源，促进新药开发。

本课题首次对山东分布的铁线莲属植物的药效作用进行比较研究。以《中国药典》收载的威灵仙为抗炎、镇痛的阳性对照，对试验药材进行比较研究，从研究结果可以看出，褐紫铁线莲、大叶铁线莲、毛果扬子铁线莲大剂组的抗炎、镇痛效果与威灵仙疗效相似, 且有随给药浓度升高药效增强的趋势。也就是说，加大上述三味药的剂量可以用于镇痛抗炎的治疗。而本试验显示烟台山蓼不具明确的镇痛抗炎效果，是否可用于临床镇痛消炎，有待进一步探讨。

山东省分布的铁线莲属植物各化学成分的药理作用机制及其构效关系的研究尚不够深入，下一步将进一步研究药理与构效的关系。