五味子素B增强胶质瘤细胞U-251MG化疗敏感性

刘红艳， 张婷， 朱慧敏， 刘丽， 张晓东

（1.恩施土家族苗族自治州中心医院肿瘤放疗中心，湖北恩施 445000；2.湖北民族大学附属民大医院肿瘤科，湖北恩施 445000）

胶质瘤是原发性脑肿瘤中最严重和侵袭性最强的一种[1]。替莫唑胺（temozolomide）应用于临床上新诊断的恶性胶质瘤和复发性恶性胶质瘤的治疗。替莫唑胺的临床应用是近10 年来恶性胶质瘤化疗的最大亮点，其联合放疗已成为胶质瘤的标准治疗方法[2-5]。替莫唑胺的治疗机制主要是能有效地抑制胶质瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡[5]，然而，胶质瘤细胞通常对替莫唑胺产生抵抗并降低替莫唑胺的细胞毒性。替莫唑胺产生化学耐药性是胶质瘤患者预后不良的主要原因。提高替莫唑胺对胶质瘤细胞的敏感性具有重要的临床意义。本研究拟观察五味子素B 对人胶质瘤细胞系U-251MG增殖、凋亡和自噬的影响，探讨五味子素B是否增加替莫唑胺对胶质瘤细胞的化疗敏感性，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞与培养人胶质瘤U-251MG 细胞来源于美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection， ATCC）。 U- 251MG 细胞以体积分数10%胎牛血清（FBS）和1%青-链霉素的DMEM培养基，在37 ℃体积分数5% CO2恒温培养箱中培养。培养基每2 ～3 d更换1次。当需要收集细胞时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化。

1.2药物、试剂与仪器五味子素B（美国Selleck公司），纯度为99.94%，化学式为C23H28O6，分子量为400.46；替莫唑胺（美国Sigma-Aldrich 公司）。五味子素B 和替莫唑胺都溶于体积分数10% 二甲基亚砜（DMSO）中，母液（替莫唑胺：100 mg/mL），使用时稀释。 DMEM培养基、FBS、青霉素、链霉素和胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；DMSO、细胞计数试剂盒8（CCK-8）（美国Simga公司）；抗Beclin 1、p62、微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）、 Ki67、 cleaved Caspase-3、Caspase-3 抗体（美国Abcam 公司）。Varioskan LUX 多功能酶标仪（美国ThermoFisher 公司）；BX53正置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；TCS SP8 X 激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）；Tanon 4800 Multi凝胶成像仪（上海天能公司）。

1.3细胞实验

以不同质量浓度（0、 0.05、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μmol/L）五味子素B 处理U-251MG 细胞后，应用CCK-8 法测定细胞存活率。后续实验选择2.5 μmol/L 的五味子素B进行处理。将U-251MG 细胞分为4 组：对照组（U-251MG）、五味子素B 组、替莫唑胺组、协同组。根据Carmo A 等[6]研究确定替莫唑胺的处理浓度为100 μmol/L。

1.3.1 CCK-8测定细胞增殖能力 连续培养各组U-251MG细胞0、24、48、72、96 h，收集各组待测细胞检测细胞吸光度。首先，用培养基将CCK-8溶液稀释到10%，再用上述溶液将待测细胞制成1 × 106个/mL的细胞悬液，然后，37 ℃培养1 ～4 h，最后应用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度值。

1.3.2 Hoechst染色测定细胞凋亡情况 将U-251MG细胞消化、离心收集，用含体积分数2%FBS 的DMEM培养基重悬，调细胞密度约为1 × 106个/mL。按照说明书操作方法，加入Hoechst 33342 染液，37 ℃孵育1 h。最后，在荧光显微镜下，观察拍照。在随机选取的6个视野中，通过计算细胞核浓缩的细胞数量来确定凋亡细胞的数量。

1.3.3 免疫荧光法检测细胞LC3表达 U-251MG细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次，室温下用40 g/L 多聚甲醛固定，再用体积分数3% BSA 孵育90 min，PBS 冲洗3 次，然后在室温下用LC3 一抗孵育1 h，用0.1 g/mL 4’6-二脒基-苯基吲哚（DAPI）孵育3 min，用二抗孵育30 min。最后应用共聚焦荧光显微镜拍照，获得荧光图像。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞增殖、自噬、凋亡相关蛋白的表达 药物处理后，收集各组待测U-251MG 细胞，用PBS 清洗3 次，加入含丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）的RAPI细胞裂解液进行总蛋白提取，以牛血清白蛋白为标准，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白质样品（20 mg），100 ℃变性5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 ～2 h后加入相应的一抗，于4 ℃过夜孵育；次日，清洗后再加入辣根过氧化物酶标记（HRP）的二抗，室温孵育1 h，清洗。最后加入发光液，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用ImageJ 软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH 作为上样量参照，至少进行3 次独立的实验。

1.4动物实验

1.4.1 分组、造模与给药 为验证五味子素B 联合替莫唑胺的体内疗效，本研究采用6周龄雌性胸腺裸鼠皮下注射U- 251MG 细胞（2 × 105个/mL，Hank’s 平衡盐溶液稀释）建立异位异种移植瘤模型。动物分为4组，即对照组、五味子素B组、替莫唑胺组、协同组，每组小鼠8 只。U-251MG细胞注射后第1天，五味子素B组给予五味子素B 5.0 mg·kg-1·d-1灌胃，替莫唑胺组给予替莫唑胺2.0 mg·kg-1·d-1灌胃。给药30 d 后所有小鼠给予颈椎脱臼法处死。

1.4.2 肿瘤体积观察 用游标卡尺测量肿瘤直径，计算肿瘤体积，公式：椭球体的体积= 长×（宽）2× 0.5。

1.4.3 免疫组织化学法检测肿瘤组织Ki67、Caspase-3表达 石蜡包埋的肿瘤切片（2 μm）经脱蜡后，用柠檬酸缓冲液进行热诱导抗原修复。内源性过氧化物酶在室温下用体积分数20%过氧化氢 阻 断15 min， 然后分别用抗Ki67 抗体、 抗Caspase-3 抗体孵育30 min。将生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗孵育30 min，在Tris-HCl缓冲液（TBS）中洗涤后，用过氧化物酶标记的链霉亲和素试剂和3，3’-二氨基联苯胺（DAB）孵育复染5 min。脱水干燥后显微镜下观察。

1.5统计方法采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，实验数据均以均数± 标准差（±s）表示，两两比较用独立的t检验，分析比较处理组与对照组之间增殖倍数、凋亡率以及蛋白表达的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1五味子素B降低胶质瘤细胞U-251MG存活率选择如图1 所示梯度浓度的五味子素B 处理U-251MG 细胞48 h 后，采用CCK-8 法测定细胞存活情况。五味子素B 在1 μmol/L 及以下的浓度时，细胞存活率无显著性差异（P＞0.05）；五味子素B 2.5 μmol/L 及以上浓度时，细胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01，与对照组比较），表现出细胞毒性。故选择对U-251MG 细胞低毒性的剂量2.5 μmol/L作为五味子素B 单独或联合处理浓度进行后续实验。

图1 不同质量浓度五味子素B降低胶质瘤细胞U-251MG存活率Figure 1 Different mass concentrations of Schisandrin B deceases survival rate of U-251MG cells

图2 五味子素B增强替莫唑胺诱导的U-251MG增殖抑制和凋亡Figure 2 Schisandrin B enhances temozolomide-induced proliferation inhibition and apoptosis in U-251MG cells

2.2五味子素B增强替莫唑胺诱导的U-251MG增殖抑制和凋亡如图2-A 所示，与对照组比较，五味子素B 组、替莫唑胺组和协同组促进U-251MG细胞凋亡（P＜0.01），且协同组的促进作用优于替莫唑胺组（P＜0.01）。如图2-B所示，与对照组比较，五味子素B组、替莫唑胺组和协同组均抑制U-251MG细胞的生长（P＜0.01），且协同组的抑制作用优于替莫唑胺组（P＜0.05）。通过对U-251MG细胞凋亡关键蛋白Ki67和cleaved Caspase-3的Western Blot 分析，验证了上述结果，如图2-C、-D所示，与对照组比较，五味子素B组、替莫唑胺组和协同组U-251MG细胞Ki67的相对表达水平显著降低（P＜0.05），而cleaved Caspase-3 的相对表达水平升高（P＜0.05），且协同组的作用效果优于替莫唑胺组（P＜0.05）。

2.3五味子素B增强替莫唑胺诱导的U-251MG细胞自噬采用免疫荧光法检测LC3 表达情况如图3-A 所示，与对照组比较，五味子素B 组、替莫唑胺组和协同组U-251MG 细胞LC3 表达水平明显升高，且协同组升高作用优于替莫唑胺组（P＜0.01）。 Western Blot检测结果如图3-B所示，与对照组比较，五味子素B组、替莫唑胺组和协同组均显著下调细胞自噬关键蛋白p62 蛋白水平，上调Beclin 1 蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.01），且协同组上调Beclin 1 蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的作用和下调p62 蛋白表达的作用优于替莫唑胺组（P＜0.01）。

图3 五味子素B增强替莫唑胺诱导的U-251MG细胞自噬Figure 3 Schisandrin B enhances temozolomide -induced autophagy in U-251MG cells

2.4五味子素B增强替莫唑胺诱导的肿瘤生长抑制如图4-A 所示，从左至右分别为对照组、五味子素B组、替莫唑胺组和协同组小鼠体内取出的肿瘤。与对照组比较，五味子素B组、替莫唑胺组和协同组肿瘤体积明显减小（P＜0.01）；与替莫唑胺比较，协同组肿瘤体积更小（P＜0.01）。具体结果见图4-B。免疫组织化学法分析肿瘤组织Ki67和Caspase-3的表达，如图5-A、-B所示，与对照组比较，五味子素B 组、替莫唑胺组和协同组Ki67 的表达水平均明显降低，Caspase-3 的表达水平升高，且协同组对Ki67的降低作用与对Caspase-3的升高作用明显优于替莫唑胺组（P＜0.01）。

图4 五味子素B协同替莫唑胺抑制胶质瘤生长Figure 4 Schisandrin B enhances the effect of temozolomide on inhibit glioma growth

图5 五味子素B协同替莫唑胺抑制胶质瘤Ki67表达、促进Caspase-3表达Figure 5 Schisandrin B enhances the effect of temozolomide on inhibiting Ki67 expression and promoting Caspase-3 expression in glioma

3 讨论

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的果实，味酸，性温，有敛肺滋肾、生津止汗、涩精止泻、安神的功效，可治久嗽虚喘、消渴、津少口干、自汗、盗汗、遗精、久泻、瞳孔散大、健忘、失眠等病症。五味子素B（schisandrin B）是从五味子中提取出来的有效成分。药理学研究表明，五味子素B不仅用于治疗神经退行性疾病[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]，还可抑制胶质瘤[10-12]。然而，既往研究未见有关五味子素B 是否增加替莫唑胺对胶质瘤细胞的化疗敏感性的报道。本研究体外实验结果显示，五味子素B 抑制U-251MG 细胞的活力（P＜0.05 或P＜0.01）。与对照组比较，五味子素B组、替莫唑胺组和协同组均增加U-251MG 凋亡细胞比率，升高细胞cleaved Caspase-3 表达水平，增加细胞核内LC3 阳性色斑，减弱p62表达，增强Beclin 1表达及升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（均P＜0.01）。体内实验结果显示，与对照组比较，五味子素B组、替莫唑胺组和协同组均减小异种移植胶质瘤体积，降低Ki67 表达，增强Caspase-3 表达（均P＜0.01）。且协同组的上述作用效果均优于替莫唑胺组（均P＜0.01）。表明五味子素B可抑制胶质瘤细胞增殖，促进胶质瘤细胞凋亡，诱导胶质瘤细胞自噬。与上述研究[8-12]一致，证实了五味子素B的抗胶质瘤作用，同时表明五味子素B对替莫唑胺化疗的治疗效果有协同增效作用。

胶质瘤是一种具有高度增殖和侵袭能力的恶性肿瘤[13]。同时，胶质瘤是对传统化疗最具抵抗力的肿瘤之一，即使经过传统的手术切除结合化疗或放疗，患者的生存率仍然较低[14-15]。为了克服这一障碍，目前的研究主要集中于化疗药物与其他药物的结合应用以及新型分子靶向药物的开发[16-18]。近年来，胶质瘤替莫唑胺治疗的改进被广泛报道，microRNAs、中药提取物被证明可增强替莫唑胺对胶质瘤的敏感性[19-22]。本研究结果表明，五味子素B 可协同替莫唑胺杀伤胶质瘤U-251MG细胞和小鼠异种移植瘤。单独五味子素B处理，其增殖抑制作用、凋亡和自噬促进作用不如单独替莫唑胺处理强，说明单独五味子素B治疗胶质瘤疗效不如替莫唑胺，替莫唑胺仍是胶质瘤化疗的相对更有效的药物。然而，将五味子素B和替莫唑胺联合使用，表现出比单独替莫唑胺使用更强的抗胶质瘤潜力，说明五味子素B可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞和肿瘤的敏感性，降低胶质瘤对替莫唑胺的抵抗性。

综上所述，五味子素B可以诱导胶质瘤细胞凋亡和自噬，具有抗胶质瘤细胞增殖和肿瘤生长的作用。同时，五味子素B可增强替莫唑胺对胶质瘤的敏感性，增强替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖的抑制作用、对细胞凋亡和自噬的促进作用，且五味子素B增强了替莫唑胺对胶质瘤实体瘤生长的抑制作用。